電子線トモグラフィー
電子線トモグラフィーとは、電子顕微鏡を用いた3次元再構成法の一つで、同一視野を様々な方向からの投影された電子顕微鏡像をコンピュータの中で三次元像に再構成し、コンピュータを使って断層像(トモグラム)を作成する手法です。
下記にその手順を順に述べていきます。
目次
連続傾斜像の撮影
1軸回転 2軸回転 |
画像の補正
傾斜画像では、視野全体がアンダーフォーカスとなるように、通常の電子顕微鏡撮影よりも大きなデフォカース値をとる場合が多いです。その場合、LaB6などの電子銃では第一トーンリングより外側の情報がほとんど無いために、CTF補正等は必要ありませんが、電界放出銃を利用した場合には、場合によっては間違った情報を与える場合があるので注意が必要です。
ラフ・アラインメント
傾斜画像の中心付近の画像の相関から、それぞれの傾斜画像の大まかな位置を合わせます。
前処理(窓関数)
# For Windowing WIN_X=0.2 WIN_X_MAX=0.2 WIN_Y=0.1 WIN_Y_MAX=0.1 WIN_MODE=18
make Windowing
位置合わせ
例. 2°刻みで撮影した画像の場合
2°画像の位置を0°画像の位置に合わせる
4°画像の位置を位置補正後の2°画像の位置に合わせる
6°画像の位置を位置補正後の4°画像の位置に合わせる
.
.
mrcImageCorrelationを使用した場合
実行例1
make CorFit1
ファイン・アラインメント
実行例1
# RotMode ROTMODE=ZOYS # Rot1 ROT1MIN=10 ROT1MAX=10 ROT1D=10 # Rot2 ROT2MIN=-60 ROT2MAX=60 ROT2D=2 # Rot3 ROT3MIN=0 ROT3MAX=0 ROT3D=30 ### For mrcImageMove SHIFT2MAX=10 SHIFT3MAX=0 ### For mrcImageTiltAxisSearch TILTMIN=0 TILTMAX=20 TILTD=2
make TiltFit
9.895
補正前 | ||
補正後 | ||
xy平面 | yz平面 | zx平面 |
実行例2(繰り返し)
# For mrcImageTiltAxisSearch IN_TILT_EXT=roi # RotMode ROTMODE=ZOYR # Rot1 ROT1MIN=10 ROT1MAX=10 ROT1D=10 # Rot2 ROT2MIN=-60 ROT2MAX=60 ROT2D=10 # Rot3 ROT3MIN=0 ROT3MAX=0 ROT3D=10 ### For mrcImageTiltAxisSearch TILTMIN=-10 TILTMAX=10 TILTN=10 TILTITER=100 TILTSCALE=5
make TiltFit
0.084 0.161 0.230 0.294 0.345 -中略- 0.701 0.700 0.685 0.706 0.701
3次元再構成
最小 最大 |
0 (0, 0, 0) 4 (31, 26, 26) |
mrc2Dto3Dで実行
実行例1
# For Reconstruction IN_3D_EXT=fit # RotMode ROTMODE=YOYS # Rot1 ROT1MIN=-60 ROT1MAX=60 ROT1D=2 # Rot2 ROT2MIN=0 ROT2MAX=0 # Rot3 ROT3MIN=0 ROT3MAX=0
make 3DList make Input.3d
最小 最大 |
-0.00437076 (39, 34, 36) 0.00799233 (37, 34, 36) |
実行例2(2軸回転)
# For Reconstruction IN_3D_EXT=fit # RotMode ROTMODE=ZOYS # Rot1 ROT1MIN=0 ROT1MAX=0 # Rot2 ROT2MIN=-60 ROT2MAX=60 ROT2D=10 # Rot3 ROT3MIN=-60 ROT3MAX=60 ROT3D=10
make 3D
最小 最大 |
-0.00194519 (39, 34, 36) 0.00475439 (31, 23, 38) |
実行例3(Double)
.3dlst.3d: mrc2Dto3D -I $*.3dlst -o $*.3d -InterpolationMode $(IN_MODE) -m $(PRJ_MODE) -Double;
最小 最大 |
-0.412988 (38, 18, 33) 1.24043 (30, 22, 33) |
ラドン変換を使った3次元再構成で実行
位置合わせ済みの2Dリスト
↓mrcImageSinogramCreate
シノグラムリスト
↓mrcRadon2Dto3D
3Dラドンファイル
↓mrcImageInverseRadonTransform
実行例1
make Radon3D
xy平面 | yz平面 | zx平面 |
最小 最大 |
522.652 (63, 61, 63) 1800.12 (31, 24, 34) |
実行例2
### RadonTransform RBP_MODE=4 RBP_OPTION=-Rmin 0.05 -Rmax 0.1 .3dradon.3d: mrcImageInverseRadonTransform -i $*.3dradon -o $*.3d -bpm $(RBP_MODE) $(RBP_OPTION);
make Radon3D
xy平面 | yz平面 | zx平面 |
最小 最大 |
-48.3524 (31, 0, 31) 110.505 (34, 19, 37) |
電子線トモグラフィー画像のもつ問題点
ミッシングエリア
最小 最大 |
0 (0, 0, 0) 2 (29, 29, 14) |
# Initial Reference Model INITIAL=Input-ellipsoidal # For mrcImageCorrelation IN_CORR_EXT=roi IN_CORR_LIST=ROIs ### For mrcImageMove SHIFT2MAX=0 SHIFT3MAX=0
make TestData make CorFit1 make CorFit2 make 3D
# Rot2 ROT2MIN=-60 ROT2MAX=60 ROT2D=10 # Rot3 ROT3MIN=0 ROT3MAX=0 ROT3D=10
最小 最大 |
-0.00196191 (61, 38, 32) 0.00269849 (24, 21, 37) |
# Rot2 ROT2MIN=-60 ROT2MAX=60 ROT2D=10 # Rot3 ROT3MIN=-60 ROT3MAX=60 ROT3D=10
最小 最大 |
-0.00143731 (50, 32, 45) 0.00230465 (53, 31, 37) |
画像の位置、フォーカスの問題
平行移動の補正
軸の決定
トモグラフに使われる画像処理
平滑化
実行例1
最小 最大 |
-0.00268221 (76, 92, 66) 0.00642324 (89, 42, 71) |
最小 最大 |
-0.00136636 (75, 42, 133) 0.00292404 (94, 65, 68) |
セグメンテーション
3次元画像の切り出し
実行例1
最小 最大 |
-0.00136636 (75, 42, 133) 0.00292404 (94, 65, 68) |
最小 最大 |
-0.0012017 (5, 9, 13) 0.00263957 (13, 6, 15) |
2次元画像の切り出し
実行例1
make all
切り出し部分決めてEdit->OKで決定します。 |
複数切り出したいときはROI->MultiROIを選択します。 |
今回はInformationだけ作成すれば、切り出しは自動で行われます。 ROI InformationウィンドウにてInfoFileName右側のsaveボタンを押すとファイルが作成されます。 |
p1_031-0000.roi Rect 20 30 60 30 60 70 20 70 p1_031-0001.roi Rect 15 75 55 75 55 115 15 115 p1_031-0002.roi Rect 25 110 65 110 65 150 25 150 p1_031-0003.roi Rect 45 0 85 0 85 40 45 40 p1_031-0004.roi Rect 60 50 100 50 100 90 60 90 p1_031-0005.roi Rect 55 80 95 80 95 120 55 120 p1_031-0006.roi Rect 55 120 95 120 95 160 55 160 p1_031-0007.roi Rect 85 15 125 15 125 55 85 55 p1_031-0008.roi Rect 85 51 125 51 125 91 85 91 p1_031-0009.roi Rect 85 91 125 91 125 131 85 131 p1_031-0010.roi Rect 93 130 133 130 133 170 93 170 p1_031-0011.roi Rect 115 25 155 25 155 65 115 65 p1_031-0012.roi Rect 120 60 160 60 160 100 120 100 p1_031-0013.roi Rect 123 100 163 100 163 140 123 140 p1_031-0014.roi Rect 115 140 155 140 155 180 115 180 p1_031-0015.roi Rect 152 152 192 152 192 192 152 192
-60° | 0° |
60° |
xy平面 | |
yz平面 | |
zx平面 |
トモグラム画像の解釈
また、多様な構造を含むため、3次元画像から興味あるセグメントを切り出すなどの作業が必要です。そのための支援ソフトウェアが必要です。
サブトモグラムの平均化
xy平面 | yz平面 | zx平面 |
実行例1
xy平面 | |
yz平面 | |
zx平面 |
最小 最大 |
-0.0012017 (5, 9, 13) 0.00263957 (13, 6, 15) |
xy平面 | |
yz平面 | |
zx平面 |
最小 最大 |
-0.000536652 (6, 13, 12) 0.00177258 (13, 17, 13) |
実行例2
xy平面 | |
yz平面 | |
zx平面 |
最小 最大 |
-5.47817 (34, 19, 20) 16.0715 (31, 22, 19) |
xy平面 | |
yz平面 | |
zx平面 |
最小 最大 |
-2.32263 (22, 29, 20) 5.20816 (19, 24, 22) |