「RELION3チュートリアル」の版間の差分

提供: Eospedia
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(1.7 Making templates for auto-picking (自動ピッキングのための参照像作成))
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【Run!】を推した時にエラーが発生した場合 → [[RELIONトラブルシューティング]]
+
【Run!】を推した時にMPI系のエラーが発生した場合 → [[RELIONトラブルシューティング]]
  
 
===1.8 Selecting templates for auto-picking (自動検出のためのテンプレート選択)===
 
===1.8 Selecting templates for auto-picking (自動検出のためのテンプレート選択)===

2019年5月21日 (火) 10:20時点における版

前書き

  • 本ドキュメントは、RELION3のチュートリアルを日本語訳し、図や補足説明などを追加して充実化したものです(Sjors Scheres博士の許可を得ています)。
  • 誤訳等がある場合には、ご連絡いただけますと幸いです。少しずつ、良いものにしたいと思います。
  • 本ドミュメントは随時更新中です。webブラウザにキャッシュが残っていると古い版の図が表示される場合があるようです。キャッシュを消してから見ていただくと安全です。


実行環境

CTF estimationジョブを除き、1回目のParticle extractionまで

Ubuntu 16.04.6 LTS

  • 3.6 GHz Intel Xeon E5-1650 (6core/12thread)
  • 64 GB 2133 MHz DDR4
  • NVIDIA GeForce GTX 1080 8 GB x 4台
    • Driverバージョン 418.74
    • CUDAバージョン 10.1

RELION version 3.0.5

  • Build from source


※GctfバイナリがCUDA10.1に対応しなかったのと、MPI関係で問題が生じたので、以下の環境に切り替えました。

CTF estimationジョブと、1回目の2D classification以降

CentOS 7 on Docker 18.09.6 with NVIDIA Docker2

  • ハードウェアとRELIONバージョンは上記と同じ
  • CUDAバージョンは 9.2

(参考) DockerでRELION


目次

1 Preprocessing (前処理)

1.1 Getting organized (解析の準備)

まず構造解析プロジェクトのディレクトリを作成します。1つの構造解析プロジェクトにつき1つのディレクトリを作成することを推奨します。これをプロジェクトディレクトリと呼びます。RELION GUIはプロジェクトディレクトリ直下から起動するようにしてください。次に、プロジェクトディレクトリの中に、未処理の電顕画像または動画を格納するためのディレクトリを作成し、そこへ画像または動画を格納します。サポートされているファイル形式はMRCまたはTIFFです。ディレクトリ名は、全ての動画を1つのディレクトリに納めるならばMovies/、例えば撮影日別でいくつかのディレクトリに分けて納めたいならばMovies/15jan16、Movies/23jan16のようにすると良いです。何らかの理由によりRELIONのプロジェクトディレクトリの中に動画を置きたくない場合は、動画を格納したディレクトリのシンボリックリンクをプロジェクトディレクトリ内に作成すれば良いです。

画像ファイル名の拡張子は .mrc、動画ファイル名の拡張子は .mrcs または .tiff とする必要があります。チュートリアル用のテストデータを解凍すると、中にMovies/ディレクトリが存在し、その中にTIFF形式の動画24本、ゲインリファレンスファイル(gain.mrc)、データ収集条件に関する情報が記載されたNOTESファイルが含まれています。

RELION GUIを起動してみましょう。前述のように、GUIは常にプロジェクトディレクトリからの起動が必要です。誤ってプロジェクトディレクトリ外から起動することを防ぐため、GUIは新しいディレクトリで初めて起動された場合、ユーザーに確認を要求します。その為、新しいディレクトリで初めてGUIを起動するときは、"&"を付けてバックグラウンド起動することは避けてください。プロジェクトディレクトリの中にいることを確認し、次のコマンドでGUIを起動します($はコマンドプロンプトを表します)。

$ relion

確認ダイアログに対し"y"と入力すると、RELIONプロジェクトがセットアップされ、GUIが立ち上がります。


RELION3のGUIウィンドウ.png


まずはじめに、動画ファイル達を解析パイプラインにインポートします。ジョブタイプブラウザから”Import”を選択すると、以下の様な入力画面が出てきます。


Importジョブ.png


以下の様にパラメータを指定します。


Importジョブのパラメータ
説明
Input files Movies/*.tiff Movies/以下のすべての.tiffファイル(動画ファイル)をインポートします。
Node type 2D micrograph movies 各ファイルを2次元の画像がスタックされた動画ファイルとしてインポートします。


Current job: Give_alias_here と書かれたフィールドに、このインポートジョブに対するエイリアス名を入力できます(例: movies)。【Run!】ボタンを押すとジョブが実行され、Import/job001 という名前のディレクトリが作成されます。エイリアス名を指定した場合はImport/moviesというシンボリックリンクも作成されます。作成されたディレクトリ内にはSTARファイルと、インポートされた全ての動画ファイルが格納されています。次のコマンドでSTARファイルの中身を確認してみましょう。

$ less Import/job001/movies.star

data_
loop_
_rlnMicrographMovieName
Movies/20170629_00021_frameImage.tiff
Movies/20170629_00022_frameImage.tiff
Movies/20170629_00023_frameImage.tiff
Movies/20170629_00024_frameImage.tiff
Movies/20170629_00025_frameImage.tiff
Movies/20170629_00026_frameImage.tiff
Movies/20170629_00027_frameImage.tiff
Movies/20170629_00028_frameImage.tiff
Movies/20170629_00029_frameImage.tiff
Movies/20170629_00030_frameImage.tiff
Movies/20170629_00031_frameImage.tiff
Movies/20170629_00035_frameImage.tiff
Movies/20170629_00036_frameImage.tiff
Movies/20170629_00037_frameImage.tiff
Movies/20170629_00039_frameImage.tiff
Movies/20170629_00040_frameImage.tiff
Movies/20170629_00042_frameImage.tiff
Movies/20170629_00043_frameImage.tiff
Movies/20170629_00044_frameImage.tiff
Movies/20170629_00045_frameImage.tiff
Movies/20170629_00046_frameImage.tiff
Movies/20170629_00047_frameImage.tiff
Movies/20170629_00048_frameImage.tiff
Movies/20170629_00049_frameImage.tiff

このSTARファイルは動画ファイル名(パス)を記録しただけの単純なものです。無名のデータブロック"data_"があり、"loop_"により _rlnMicrographMovieName をラベルとし動画ファイル名を値とするラベル-値ペアを24個記述したSTARファイルとなっています。RELIONで定義されているラベル名の一覧はこちらをご覧ください→RELIONの定義済みラベル


もしRELION以外のソフトウェアで単粒子切り出しなどを行った場合、以下の前処理ステップを飛ばし、"Import"ジョブタイプを使って単粒子のSTARファイル、3D参照像、3Dマスク等をインポートすることができます。ただし、これはRELIONを使う上で推奨される方法ではなく、適切なSTARファイルの作成はユーザー自身で行う必要があることに注意してください。

1.2 Beam-induced motion correction (電子線誘起性ドリフトの補正)

Motion correctionジョブタイプは、動画のフレームアラインメントプログラムであるUCSF MOTIONCOR2を用いて、電子線誘起性ドリフトを補正します。RELIONバージョン3.0以降はMOTIONCOR2と同じアルゴリズムがRELION自体に実装されており、そちらを使うこともできます。ただしRELION実装版はCPUでのみ動作します。

Motion correctionジョブタイプの設定はI/O、Motion、Runningの3つのタブに分かれています。それぞれパラメータを入力した状態の画面を以下に示します。

MotionCorrection IOtab.png

MotionCorrection Motiontab.png

MotionCorrection Runningtab.png


パラメータの一覧とその説明を次の表に示します。


Motion correctionジョブのパラメータ
タブ パラメータ名 説明
I/O Input movies STAR file Import/job001/movies.star 動画ファイルの一覧が記録されているSTARファイルをインポートする。BrowseボタンでImport/movies/movies.starを選択すると、エイリアス名moviesがjob001 (真のジョブの名前)に勝手に置き換わった。また、Browseボタンでファイル検索する際、movieのSTARファイルしか表示されないことにも注目。各ジョブタイプに対応したSTARファイルのみが表示される仕様の様。
I/O First frame for corrected sum 1 アラインメント後の積算画像作成に含める最初のフレーム。
I/O Last frame for corrected sum -1 アラインメント後の積算画像作成に含める最後のフレーム。0以下であれば、動画ファイルの一番最後のフレームを指す。Firstに1、Lastに-1を指定したので、つまり動画内のすべてのフレームを積算画像作成に使用することを意味する。
I/O Pixel size (A) 0.885 検出器の1画素が試料面上で何Åに相当するか[Å/pixel]。検出器の画素の大きさ(μmオーダー)を撮影倍率で割れば求まる。
I/O Voltage (kV) 200 加速電圧 [kV]
I/O Dose per frame (e/A2) 1.277 各フレームでの、試料面上での電子線のフルエンス。1フレーム分の露光中に、試料1平方Å当たりに何個の電子が当たったか[electron/A^2]で表す。ドース(dose)とも呼ばれる。
I/O Pre-exposure (e/A2) 0 動画の記録を始める前に試料に当てられた電子線のフルエンス。動画の最初の数フレームを捨てた場合などに使用。(歴史的には、まだ電子直接検出器がなかった時代、液体ヘリウム冷却式のクライオ電顕での撮影時に、電子線誘起性ドリフトを軽減する目的で、撮影前に一定量の電子線を当てることがあり、それをpre-exposureと呼んだ。)
I/O Do dose-weighting? Yes アラインメント後の積算画像作成の際に、累積フルエンスに基づくフレーム重み付け(dose-weighting)を行うか否か。累積フルエンスが多くなるほど試料に損傷が蓄積し、高周波数のシグナルが失われることがわかっているため、累積フルエンスが大きくなる後ろの方のフレームは高周波数成分の寄与を落とすような処理を行う。
I/O Save non-dose weighted as well? No 上でYesを選択した場合、dose-weightingを行なっていないアラインメント後積算画像も保存するか否か。dose-weightingを行わない方がCTF推定がうまくいく場合もある。今回はディスク容量節約のためNoとする。(こうしたことをせずとも十分良質なデータなので、そもそも不要ではある)
Motion Bfactor 150 各フレームに適用するガウス関数型ローパスフィルタのパラメータ[pixel^2]。Motion Correction v1の論文(Xuemin Li et al., Nature Methods, 2013)によれば、Bfactor(B)の式はexp(-Bk^2)で(k:空間周波数)、これがフレームのフーリエ変換に掛け算されて(Bが正の時は)ローパスフィルタとなる。Bfactorが大きいほどローパス効果が強い。高周波数のノイズがアラインメントの邪魔となるため、このような処理をする。Gatan K2-summitで超解像モードを使用した場合はより大きな値を指定した方が良い。
Motion Number of patches X, Y 5, 5 異方的な(場所ごとに異なる)電子線誘起性ドリフトを補正するために、フレームを5x5のパッチに分割し、各パッチ別でドリフト量を推定し、それを多項式函数でフィティングして画素単位でドリフト量を推定、アラインメントする。X, Y共に1とすればフレーム全体のズレのみ推定、アラインメントされる。
Motion Group frames 1 この値が例えば2だと、ドリフトの推定処理前に隣接2フレームが平均化(Grouping)され、その平均化フレームを用いてドリフト推定される。S/Nが低い動画のドリフト推定では有効なオプションだろう。
Motion Binning factor 1 画像のビニング(縮小)率。フーリエ空間の切り出しにより行う。この段階でビニングをするとそれを後々復調するのは難しくなるが、超解像モードで撮影された動画をダウンスケール(ファイルサイズ圧縮?)するのには役に立つ。浮動小数点数を指定できる。ただし、ビニング後の画像のサイズ(画素数)が偶数となる必要がある。超解像モードの場合、Binning factor 2 がよく使われる。
Motion Gain-reference image Movies/gain.mrc カメラのゲイン補正をしない状態で動画を撮影した場合、ゲインリファレンスをここで与えることでゲイン補正できる。
Motion Gain rotation No rotation(0) ゲインリファレンスを回転する必要がある場合はこのオプションを使う。
Motion Gain flip No flipping(0) ゲインリファレンス回転後にその鏡像をとる必要がある場合はこのオプションを使う。
Motion Use RELION's own implementation? Yes MotionCor2のRELION実装版を使用するか否か。RELION実装版はCPUでマルチスレッド動作する。動画フレーム数がスレッド数の整数倍だと効率的に計算される。4k x 4kの動画で6〜12スレッド使えば、GPU実装のMotionCor2と同等の処理速度となる。RELION実装版を使わない場合(Noを選択)は、MotionCor2の実行可能ファイルパス、使用するGPUデバイス番号を指定する必要がある。
Running Number of MPI procs 1 MPIプロセス数。
Running Number of threads 12 今回の動画は24フレームのため、それを割り切れる2, 3, 4, 6, 8, 12, 24スレッドのいずれかを指定するのが効率が良い。ここでは12を指定した。
Running Submit to queue? No ジョブ・キューイングシステムで実行する場合に使用するオプション。以降ではこれに関連する項目は省く。


パラメータ入力後、【Run!】ボタンを押すとジョブが実行されます。ソースからビルドしたRELION使用時、GUI下部のウィンドウに"ERROR: TIFF support was not enabled during compilation"と表示されてジョブが停止した場合はこちらを参照ください → RELIONトラブルシューティング


ジョブの実行にかかる時間は、最近のそれなりのマシンであれば12スレッド実行で約5分程度になります(※本記事執筆者の環境(ページ上部の実行環境をご覧ください)では4.6分でした)。


【Display:】の右側のドロップダウンメニューを押すと、"out: logfile.pdf"または"out: corrected_micrographs.star"を選択できます。"out: logfile.pdf"を選択すると、電子線誘起性ドリフトの推定結果とその統計値を記録したファイルを見ることができます。(※環境によってはpdfファイル生成関係や表示関係でエラーが出て見れないかもしれません。ghost scriptとevinceをインストールすれば大体大丈夫と思います。)


motioncorr logfile button.png


logfile.pdfの内容はこちらで説明します → Motion correctionジョブのlogfile.pdf


また、【Display:】で"out: corrected_micrographs.star"を選択すると、Relion display GUIが立ち上がります。

motioncorr display1.png

パラメータを適当に入力して【Display!】ボタンを押すと、アラインメント後(ドリフト補正後)の積算画像を見ることができます。今回はScale: 0.3(画像縮小)、Sigma contrast: 3 (高コントラスト化)、Nr.columns: 3 (1行あたり3枚の画像を並べてタイル表示)程度が適当でしょう。

motioncorr display2.png


ちなみに各画像上で右クリックして表示されるポップアップメニューで、"Show metadata"を選択すると、corrected_micrographs.starに記述されているその画像のメタデータが表示されます。

motioncorr display3.png


注意点として、このディスプレイを使って画像の選別を行うことはできません。データセットから消したい画像がある場合は、"Subset selection"ジョブタイプを使いましょう。


Motion correctionジョブタイプのstarファイルについてはこちらで説明します → Motion correctionジョブのstarファイル

1.3 CTF estimation (CTF推定)

CTF estimationジョブタイプでは、ドリフト補正後の画像のCTF推定を行います。CTF estimationジョブタイプはKai Zhangが開発したGctfのラッパープログラムになっています。GctfはGPUで動作します。適当なGPUがない場合は、Alexis RohouとNiko Grigorieffが開発したCTFFIND4.1を使うことができます。CTFFINDはCPUで動作します。

以下ではGctfを使った場合について説明します。まずジョブタイプブラウザから"CTF estimation"を選択します。タブはI/O, Searches, CTFFIND-4.1, Gctf, Runningの5種類あり、そのうちGctfで使うのはI/O, Gctf, Runningの3種類です。SearchesタブとCTFFIND-4.1タブは無視されます。以下にパラメータを入力した状態の画面を示します。(Gctfがインストールされていない場合はこちらへ→ Gctf)


gctf-param-1.png

gctf-param-2.png

gctf-param-3.png


パラメータとその説明を以下の表に示します。

CTF estimationジョブのパラメータ
タブ パラメータ名 説明
I/O Input micrographs STAR file MotionCorr/job002/corrected_micrographs.star Motion correctionジョブによるドリフト補正後の画像をリストアップしたSTARファイル。
I/O Use micrograph without dose-weighting? No CTF推定にdose weightingしていない画像を用いるか否か。今回はMotion correctionジョブでdose weightingしていない画像の作成、保存をしていないため、No一択。
I/O Spherical aberration (mm) 1.4 対物レンズの球面収差係数[mm]
I/O Voltage (kV) 200 加速電圧[kV]
I/O Amplitude contrast 0.1 コントラスト全体(位相コントラスト+振幅コントラスト)に対する振幅コントラスト成分の寄与の程度を表す数値(Kai Zhang, J. Struct. Biol (2016)の式(1)を参照)。実際には0.1より小さいことが知られているが、単粒子解析的には0.1程度とした方が良い結果を得られる傾向がある。これは現状のCTFが非弾性散乱由来の低周波数成分をモデル化していないことによる誤差と考えられている。
I/O Magnified pixel size (Angstrom) 0.885 検出器の1画素が試料面上で何Åに相当するか[Å/pixel]。検出器の画素の大きさ(μmオーダー)を撮影倍率で割れば求まる。
I/O Amount of astigmatism (A) 100 想定される対物非点収差の大きさ[Å]。適切に軸調整された電顕ならばこの値で概ね上手くいく。
Gctf Use Gctf instead? Yes CTF推定にGctfを使用するか否か。Gctfを用いないならば代わりにCTFFIND-4.1を使う必要がある。
Gctf Gctf executable Gctfバイナリのファイルパス Gctfバイナリのファイルパスを指定。環境変数$RELION_CTFFIND_EXECUTABLEでファイルパスを指定済みであれば、それがデフォルト値として使われる。参考までに、本記事執筆者環境では/home/kttn/softwares/Gctf/Gctf_v1.18_b2_sm61_cu9.2
Gctf Ignore 'Searches' parameters? Yes Yesの場合、SearchesタブのCTF推定用パラメータは無視され、Gctfのデフォルトパラメータが使用される。Searchesタブでパラメータを指定してGctfに渡したい場合はこれをNoとする。
Gctf Perform equi-phase averaging? Yes 推定したCTFモデルに基づく等位相平均化(equi-phase averaging, EPA)を施したパワースペクトルを生成するか否か。EPAによりトーン(Thon)リングのS/Nが向上し、目視でのCTF推定クオリティの判定に役立つ。あくまでも人間が目で判定するために使うもので、CTF推定計算自体には影響を与えない。Kai Zhang, J. Struct. Biol(2016)の2.9節を参照。
Gctf Other Gctf options Gctfに渡したい追加のパラメータがあればここに記述。
Gctf Which GPUs to use 0 使用するGPUのデバイス番号(複数台のGPUを使用する場合は複数指定可能)。GPUデバイス番号は普通は0から始まり、GPU1台につき1つの番号が割り当てられる。今回は小規模データセットのためGPU1台で十分。
Running Number of MPI procs 1 MPIプロセスを増やしてジョブを並列化可能だが、今回はGPU1台、シングルプロセスでも全ての画像を処理するのに30秒程度しかかからないため、1で十分。


CTF estimationジョブタイプの結果生成されるSTARファイルについてはこちらで説明します → CTF estimationジョブのSTARファイル

ジョブが完了すると、CtfFind/job003/Movie/ディレクトリ以下に、各画像ごとに複数のファイルが生成されます。例えば20170629_00021_frameImage.mrcを例にとると、以下の様な画像が生成されます。(EMAN2のe2display.pyで表示しています。)


20170629_00021_frameImage.ctf : 左側がモデルのパワースペクトル 、右側が画像(実データ)のパワースペクトル 。白いリングは多分_rlnCtfMaxResolutionです。

ctf-ctf.png


20170629_00021_frameImage.epa : 左側がモデルのパワースペクトル 、右側が画像(実データ)のパワースペクトルを等位相平均化(EPA)したもの。EPAによりThonリングがよりよく見えます。

ctf-epa.png


20170629_00021_frameImage.pow : 画像(実データ)のパワースペクトル 。20170629_00021_frameImage.ctfの右半分はこれの右半分と同じもののはず...ですが、.ctfの方は何らかの都合により階調が潰れていて見えづらく、困ります。

ctf-pow.png


また、各画像ごとに.logという拡張子のテキストファイルも生成されます。これはGctfのログファイルになります。


RELION GUIの【Display】ボタンを押し、out: micrographs_ctf.starを選択すると、*.ctfを一覧表示できます(左半分がCTFモデルで右半分が画像のパワースペクトル のやつ)。Thonリング(白いリング)の間の暗環(ゼロ点と呼びます)とCTFモデルの暗環は一致しているべきです。RELION display GUIのSort imagesにチェックを入れて、on: で好きな指標を選択すると、その指標に基づいて並び替えられた状態で表示されます。

以下は例です。_rlnCtfMaxResolutionの大きいものから順に並べています(混乱しそうになりますが、大きい方が要はフィッティングの質が悪いです)。フィッティングの質に基づいてスクリーニングしたいときなどに便利です。(このチュートリアルのデータではなぜかパワースペクトルが潰れて見えないので難しいですが。)

ctf-disp1.png

ctf-disp2.png


また、【Display】ボタンからlogfile.pdfを選択すると、micrographs_ctf.starに記録されている各種推定値のプロットとヒストグラムを確認できます。推定値の説明はこちらを参照ください→ CTF estimationジョブのSTARファイル。撮影時に狙った通りの分布になっているかなどを確認しましょう。


CTFモデルの推定(フィッティング)が悪いと思われる画像がある場合は、それらの画像のみパラメータを変えて再推定することができます。まずCtfFind/job003/Movies/の中から、再推定したい画像の.logファイルを削除します。次に、GUIの【Finished jobs】リストの中からCtfFind/job003を選択し、パラメータを変更し、【Continue now】ボタンを押下すれば新規パラメータで再推定が実行されます(【Run!】ボタンが【Continue now】ボタンに変わっています)。CTF推定結果に満足するまでこのプロセスを繰り返すことができます。もしパラメータを変更して再推定してもうまくいかないものがあれば、【Subset selection】ジョブタイプでそれらの画像を以降の解析から除外しましょう。

1.4 Manual particle picking (手作業による単粒子ピッキング)

次のManual pickingジョブタイプは、(ドリフト補正により平均化された)画像から手作業で単粒子の座標を指定する(ピッキングする)ために使います。自分のデータの素性をよく知るためにも、少なくとも数枚の画像で手作業単粒子ピッキングを行うのが良いでしょう。このジョブタイプの典型的な使い方は、ここで手作業で指定した単粒子を用いて参照像無しで2Dクラス平均画像を計算し、それを参照像としてデータセット全体に対し自動単粒子ピッキングを行うというものです。しかしRELION 3.0から、ラプラシアン-オブ-ガウシアン(LoG)フィルターによる参照像無し自動単粒子ピッキングが実装されています。これまでのところ、ほとんどの場合において、LoGによる自動ピッキングでまずまずの初期座標を得られており、それゆえManual pickingジョブタイプはスキップできます。RELION付属の全自動単粒子解析スクリプトであるrelion_it.pyもLoGによる自動ピッキングを使用しています。今回このチュートリアルでは、あくまでも説明目的でManual pickingジョブタイプを触ってみることにし、その後LoGベースの自動ピッキングで単粒子の初期座標を得ることにします。


単粒子の手動ピッキングは経験あるのみです!もしRELIONのピッキングインターフェイスが使いにくければ、次のプログラムを代わりに使っても良いです(RELIONはそれらが出力する座標ファイルのフォーマットにも対応しています):Jude Shortが開発したXIMDISP (座標ファイルの拡張子は任意)、XMIPP-2.4(座標ファイルの拡張子は任意)、Steven Ludtkeが開発したe2boxer.py(座標ファイルの拡張子は.box)。それらを使用する場合には、以下のことを守ってください。

  • 座標ファイルはテキストファイルとして、画像または動画のインポート元ディレクトリ(最初のImportジョブタイプで動画を読み込む時に指定したディレクトリ)に保存すること。
    • 今回の場合はMovies/ディレクトリです。
  • 座標ファイルのrootname(ファイル名から拡張子を除いた文字列)は対応する画像ファイルのrootnameと同じにし、拡張子のみ変更すること。
    • 例として、20170629_00021_frameImage.tiff の座標ファイルの場合、Movies/20170629_00021_frameImage.box, 20170629_00021_frameImage.star など。

ピッキングができたら、Importジョブタイプより、Node type: "2D/3D particle coordinates"を選択し、Input filesに該当する座標ファイルをワイルドカードで指定(Movies/*.box、Movies/*.starなど)して座標をインポートしてください。


ここではRELIONのピッキングインターフェイスについて説明します。(e2boxer.pyによる方法はこちら)


まずManual pickingジョブタイプのI/Oタブにて、【Browse】ボタンを押し、CtfFind/job003/以下に生成されたmicrographs_ctf.starファイルを選択します。Colorsタブはここでは無視します。Displayタブには以下の通り入力します。

manualpick-display.png

Manual pickingジョブのパラメータ
タブ パラメータ名 説明
Display Particle diameter (A) 200 単粒子(蛋白質分子)の大きさ[Å]。ピッキング時に表示される円の大きさを指定するパラメータで、解析には影響を与えない。みやすい値を選べば良い。
Display Scale for micrographs 0.25 画像の表示スケール。使用しているモニタの大きさ、解像度に合わせて適宜調整する。
Display Sigma contrast 3 典型的な電顕画像は"シグマ(標準偏差)コントラスト"により見やすくなる。3とすると、画像の輝度値の平均 - 3*標準偏差が黒、平均 + 3*標準偏差が白となる様、かつ線形にヒストグラム伸長して画像を表示する。詳細はRELION wikiのDisplayImagesエントリを参照。
Display White value 0 ヒストグラム伸長の際に白となる値を自分で指定する場合はここに入力する。その場合、Sigma contrastは0とすること。
Display Black value 0 ヒストグラム伸長の際に黒となる値を自分で指定する場合はここに入力する。その場合、Sigma contrastは0とすること。
Display Lowpass filter (A) 20 画像にローパスフィルタを施してから表示する。カットオフをÅで指定する。ノイズの大きい画像で単粒子が見やすくなる場合がある。
Display Highpass filter (A) -1 画像にハイパスフィルタを施してから表示する。カットオフをÅで指定する。画像全体に乗っている明暗の勾配を除去するのに有用。-1はハイパスフィルタ無効化を意味する。
Display Pixel size (A) 0.885 ピクセルサイズ[Å/pixel]。周波数フィルタのカットオフと単粒子の大きさをpixel単位に換算するために使用。(画像のピクセルサイズと検出器のピクセルサイズのどちら??)
Display Pick start-end coordinates helices? No 線維状蛋白質をピッキングする場合に指定するオプション。
Display Scale for CTF image 1 画像の【CTF】ボタンを押下した際に表示されるパワースペクトル画像の表示スケールを指定。


【Run!】ボタンを押すと、RELION manual-picking GUIウィンドウが立ち上がります。画像名、ピッキング済みの単粒子数、デフォーカス量がリストアップされています。これを利用して単粒子ピッキングするわけですが、今回のチュートリアルではLoGによる自動ピッキングを使って解析を進めるため、ピッキングはしなくても良いです(ただしこのジョブを実行(Run)したことにより生成されるstarファイル自体は使用するので、ここまではやってください)。

pick1.png


以降の解析では使いませんが、ピッキングの方法を説明しておきます。【pick】を押せば画像が表示されます。左クリックで単粒子ピッキング、中クリックでピッキングの取り消しができます。また、右クリックでメニューが表示されます。ピッキングを終えたら右クリックメニューの"Save STAR with coordinates"を押し、座標ファイルを保存する必要があります。座標ファイルの保存は画像ごとに個別に行う必要があります。

pick2.png


座標ファイルを保存してさえいれば、ピッキングは一時中断して後からまたやり直すことができます。その場合、RELION GUIのFinished jobsペインからManualPick/job004を選択し、【Continue now】を押せばいいです。

手作業ピッキングした単粒子を使って2D classificationジョブタイプでまずまずのクラス平均像を得るためには、およそ500-1000個の単粒子が必要です。

1.5 LoG-based auto-picking (LoGに基づく自動ピッキング)

ここではラプラシアン-オブ-ガウシアン(LoG)フィルタを用いて、参照像(reference)無しでの自動ピッキングを行います。ここでピッキングした単粒子を次の2D classificationジョブタイプに渡し、Auto-pickingジョブタイプで用いる参照像を作成するというのが後の流れです。この段階ではそれほど多くの単粒子は必要無いので、今回は最初の5枚の画像についてのみLoGベースのピッキングを行うことにします。ただし、これはチュートリアルの時間を短縮するためです。実際のプロジェクトでは、より良い参照像を得るために、使える画像全部でLoGピッキングを行なっても良いでしょう。(LoGピッキングについてはZivanov et al., eLife(2018)を参照。)

まずはLoGピッキングを行う画像を選択するため、"Subset selection"ジョブタイプを使用します。I/Oタブの"OR select from picked coords"で、先ほどの"ManualPick/job004/coords_suffix_manualpick.star"を指定し、Current job:にエイリアス名 "5mics" と入力し、【Run!】を押します。 (※ Manual pickingジョブタイプでRun!するだけで生成されるSTARファイルです。単粒子を手動ピッキングしていなくても生成されています。)

subset1.png


Manual pickingジョブタイプと同様のRELION manual-picking GUIが表示されます。デフォルトでは全ての画像のチェックボックスにチェックが入っており、すなわち全ての画像が選択された状態です。manual-picking GUIのFileメニューでInvert selectionを押すと、全てのチェックボックスが外れて画像が選択されていない状態になります。最初の5枚の画像だけチェックを入れて、FileメニューでSave selectionを押します。

subset2.png


すると、Select/5mics/micrographs_selected.starに、選択した画像のファイル名やCTF情報が保存されます。これを次のLoGピッキングに用います。


LoGピッキングを行います。Auto-pickingジョブタイプを選択し、以下の様にパラメータを入力します。また、エイリアス名としてLoG_basedを指定しておきましょう。Referencesタブ、helixタブはここでは無視します。

log1.png

log2.png

log3.png

LoG pickingのパラメータ
タブ パラメータ名 説明
I/O Input micrographs for autopick Select/job005/micrographs selected.star 選択した5枚の画像情報(CTF情報含む)を記録したSTARファイル。
I/O Pixel size in micrographs (A) -1 上記でCTF情報を含むSTARファイルを指定した場合、ここで負の値を与えれば、STARファイルに記録されているピクセルサイズ[Å/pixel]が使われる。
I/O 2D reference LoGピッキングは参照像(reference)無しなので空欄にする。
I/O OR: provide a 3D reference? 同上
I/O OR: use Laplacian-of-Gaussian Yes LoGピッキングを実行する。
Laplacian Min. diameter for LoG filter (A) 150 単粒子の最小サイズ [Å]を指定すれば良い。e2display.pyなどを使って画像からおおよその値を見積もる。
Laplacian Max. diameter for LoG filter (A) 180 単粒子の最大サイズ [Å]を指定すれば良い。e2display.pyなどを使って画像からおおよその値を見積もる。
Laplacian Are the particles white? No 単粒子が背景よりも白い場合(コントラストを反転したり、CTFの位相フリッピングを行なった場合など)はYesとする。今は単粒子が背景よりも黒いのでNoとする。
Laplacian Maximum resolution to consider (A) 20 ここで指定した分解能が画像内の最大の分解能となる様に画像を縮小した上でLoGピッキングが実行される。今回はデフォルトの20Åのままで良い。
Laplacian Adjust default threshold 0 正の値にすると、すなわち閾値を高くすると、ピッキング数が減る。負の値にすると、すなわち閾値を低くするとピッキング数が増える。良い値はおそらく[-1, 1]の範囲にあるが、多くの場合デフォルトの閾値0で十分良い仕事がされる。
Reference LoGピッキングでは無視。
autopicking Picking threshold LoGピッキングでは無視。
autopicking Minimum inter-particle distance (A) LoGピッキングでは無視。
autopicking Maximum stddev noise LoGピッキングでは無視。
autopicking Minumum avg noise LoGピッキングでは無視。
autopicking Write FOM maps? No 参照像ベースのピッキングで使用する。
autopicking Read FOM maps? No 参照像ベースのピッキングで使用する。
autopicking Shrink factor 0 (RELION 3.0.5の場合)LoGピッキングではこの欄は無視され、常に0が使われる。0の場合、Laplacianタブで指定したMaximum resolution to considerの値に従い画像が縮小される。
autopicking Use GPU acceleration? No LoGピッキングは十分高速なのでGPU化されていない。
Helix LoGピッキングでは無視。


【Run!】を押せばLoGピッキングが実行されます。シングルMPIプロセスでおよそ40秒程度です。

【Display:】ボタンを押してcoords_suffix_autopickを選択するとRELION manual-picking GUIが立ち上がり、ピッキングの結果を確認できます。

rln-log4.png


Manual pickingと同じ要領で、追加で単粒子のピッキングや削除をすることができます。また、Laplacianタブの各パラメータを調整して再計算することもできます。しかし参照像あり自動ピッキングの参照像を作る目的であればこの程度のクオリティで多くの場合問題ないため、このまま先へ進みます。


また、【Display:】でout:logfile.pdfを選択すると、各画像でピッキングされた単粒子数(_rlnGroupNrParticles)のプロットとヒストグラム、各画像のピッキングの平均FOM(ピッキングスコアの指標, _rlnAutopickFigureOfMerit)のプロットとヒストグラムを確認できます。


LoGピッキングの結果生成されるSTARファイルについてはこちらをご覧ください→ LoGピッキングのSTARファイル

1.6 Particle extraction(単粒子の切り出し)

単粒子を切り出したい画像の座標ファイルを得られたら、Particle extractionジョブタイプにより単粒子を切り出し、そのメタデータを集めることができます。Particle extractionジョブタイプを選択し、以下の様にパラメータを指定します。あとから行う切り出しと区別するため、LoG_basedとうエイリアス名を指定しておきます。

rln-extract-log-1.png

rln-extract-log-2.png

LoGピッキング結果に基づくParticle extractionのパラメータ
タブ パラメータ名 説明
I/O micrograph STAR file CtfFind/job003/micrographs_ctf.star Browseボタンを使って指定する。Select/5mics/にあるmicrographs_selected.starを使うこともできる。いずれにせよ単粒子の座標は最初の5枚の画像についてしか用意していないため、どちらを使っても良い。単粒子の座標が指定されていない画像があると【Run!】した時にGUIの下部ウィンドウ(stderr)に赤字で警告が出るが、無視して良い。(※他のエラーや警告まで見逃さない様に注意)
I/O Input coordinates AutoPick/job006/coords_suffix_autopick.star Browseボタンを使って指定する。
I/O OR re-extract refined particles? No このオプションは2D classification、3D classification、3D auto-refineジョブタイプで生成される _data.star ファイルを用いて、STARファイル内に記録されている情報を元に単粒子を再切り出しするために使う。例えば、はじめに単粒子を縮小して切り出し、2Dまたは3Dの分類(classification)を行った後に、今度は元の縮小前のスケールで切り出し直したい、といった場合に有用。RELION3ではこの機能をさらに拡張した"re-center refined coordinates"というオプションが追加されており、3D classificationや3D auto-refineで用いる3D参照像内における任意の点(x, y, z)を指定できる。それを用いると、全ての単粒子のx, y座標の原点が調整され、その結果得られる3D再構成像はそこで指定したx, y, z座標が中心にくる。Focused refinementを行う際に有用。
I/O Manually set pixel size? No 入力STARファイル(micrograph STAR file)にピクセルサイズの情報が記録されていない場合はこれをYesにし、Pixel size[Å/pixel]を手入力する。
extract Particle box size (pix) 256 単粒子の切り出しサイズ [pixel]。256x256の大きさで切り出される。偶数でなければならない。
extract Invert contrast? Yes 白黒反転して単粒子が背景よりも白くなる様にする。
extract Normalize particles? Yes 画像は常に正規化する。正規化については下記参照。
extract Diameter background circle (pix) 200 単粒子の中心を中心とする直径200pixelの円の外側を背景領域と見なし、背景領域の輝度値の平均が0、標準偏差が1となる様に単粒子画像を正規化する。負の値を指定すると、Particle box sizeの75%の値が使われる。
extract Stddev for white dust removal -1 異常に明るい画素(があれば)を取り除くために使用。平均よりも標準偏差xこの値倍を超えて大きい輝度値を持つ画素は、ガウス分布からサンプリングした別の値で置き換えられる。5程度が典型的。今回のデータセットは異常画素が存在しないので、-1を指定して無効化する。
extract Stddev for black dust removal -1 異常に暗い画素(があれば)を取り除くために使用。平均よりも標準偏差xこの値倍を超えて小さい輝度値を持つ画素は、ガウス分布からサンプリングした別の値で置き換えられる。5程度が典型的。今回のデータセットは異常画素が存在しないので、-1を指定して無効化する。
extract Rescale particles? Yes 単粒子画像を縮小するか否か。縮小すると計算が高速化される。最初のクラス分類を高速化するために、解析の初期段階では単粒子画像を縮小するのが典型的。再構成像の分解能がナイキスト周波数に近づいてきたら、縮小なしで単粒子を再切り出しし、高分解能解析に進む。
extract Re-scaled size (pixels) 64 縮小後の単粒子画像のサイズ[pixel]。今回は256x256 → 64x64へと縮小する。


Helixタブは今回は無視し、RunningでシングルMPIプロセスにして【Run!】実行します。


単粒子画像はMRCスタックとして切り出し元画像ごとに1つのファイルにまとめて書き出されます(RELIONでは.mrcsの拡張子を持ちます)。保存場所はExtract/job007/Movies/になります。切り出し後は、特に問題が起きていないか確認するため、単粒子画像の様子をざっと確認しましょう。【Display】でout:particles.starを選択するとRelion display GUIが立ち上がるので、適当にパラメータを指定して【Display!】を押し、表示します。

rln-extract-log2.png


切り出した単粒子画像の平均画像を確認することもできます。画像ウィンドウ上で右クリックし、メニューから"Invert selection"を選択すると全ての単粒子画像が選択され(選択されると赤枠で表示されます)、さらに右クリックメニューから"Show average of selection"を選ぶと平均画像が表示されます。

rln-extract-log3.png


Particle extractionジョブで生成されるSTARファイルについてはこちらで説明します → Particle extractionジョブのSTARファイル

1.7 Making templates for auto-picking (自動ピッキングのための参照像作成)

参照像ベースの自動ピッキングで用いる参照像を得るために、2D classificationジョブタイプを利用します。

2D classificationジョブタイプを選択し、以下の通りパラメータを入力します。

rln-2dclass-log1.png

rln-2dclass-log2.png

rln-2dclass-log3.png

rln-2dclass-log4.png

rln-2dclass-log5.png


【Run!】を推した時にMPI系のエラーが発生した場合 → RELIONトラブルシューティング

1.8 Selecting templates for auto-picking (自動検出のためのテンプレート選択)

適切なクラス平均画像の選択は【Subset selection】jobで行われます。【Class option】タブ上に与えられたSelect classes from model.starと書かれた行の横にある【Browse】ボタンを利用して、【I/O】タブ上のClass2D/manualpick/run_it025_model_.starファイルを選択してください。

 ● Re-center the class averages?: Yes

(このオプションは、2次元クラス平均の自動センタリングが可能です。画像のセンタリングはその重心を基準としており、粒子の白(黒ではない)の部分をもとに計算されます。センタリングされたテンプレートが自動検出中に必要となる一方で、2D classification実行時ではクラス平均はセンタリングされないかもしれないので、再センタリングがしばしば必要となります。特にオートピッキングのためにクラスの平均画像を使用する場合、それが中心にあることが重要です。さもないと、すべての粒子座標が体系的に中心から外れてしまうためです。)

 ● Regroup the particles? No

(これは、それぞれの電子顕微鏡写真にある(選ばれた)粒子が非常に少ない場合に便利なオプションです。そのような場合、スペクトルノイズ強度とスケールファクターの推定が不安定になることがあります。デフォルトでは、スケールファクターの推定は顕微鏡写真ごとにそれぞれ計算されます。このオプションは計算実行時、複数の顕微鏡写真の粒子を一緒に計算してグループ化することが可能です。RELIONは、(クラス分類や自動精密化実行の際に)グループがとても小さくなっている場合に警告を出します。)

templates4autopickのようなエイリアスはとてもいいアイディアです。rlnClassDistributionカラムに基づいたクラス平均を再び求める可能性があります。代表となりそうな、見た目が異なる粒子のクラス平均を4〜6つ選択してください。見た目が似ているものを繰り返し選択したり、よくないクラス平均を含めたりしないでください。選択するにはクラス平均上で左クリックしてください。右クリックでポップアップメニューからSave selected classes オプションを使うことで、選択したクラス平均を保存できます。

1.9 Auto-picking(自動検出)

【Auto-picking】jobタイプでは、テンプレートとして選択された2次元クラス平均を使います。ただしすべての顕微鏡写真で自動ピッキングを実行する前に【auto piking】タブ上で4つの主要なパラメータ―を最適化する必要があります。the piking threshold、the Minimum inter-particle distance、the Maximum stddev noiseとthe Minimum avg noiseです。これは時間を短縮するために数枚の顕微鏡写真のみで行われます。LoG_basedのオートピッキング用に選んだのと同じ5つの顕微鏡写真を利用します。 次に、[auto piking]jobでの[I/O]タブ設定:

 ● Input micrographs for autopick: Select/5mics/micrographs.star
 ● Pixel size in microgfraphs (A): -1

(ピクセルサイズは、入力STARファイルの情報から自動的に設定されます。)

 ● References: Select/templates4autopick/class_averages.star
 ● OR: provide a 3D reference?No
 ● OR: use Laplacation-of-Gausssian?No

【References】タブでの設定:

 ● Lowpass filter references (A): 20

("Einstein-from-noise"のアーティファクトを避けるために、データから得ようとしている最終的な分解能よりも大幅に低いローパスフィルターを使用することは非常に重要です。)

 ● Highpass filter (A): -1

(たとえば200などの正の値を渡した場合、リファレンスの顕微鏡写真はオートピッキングよりも高いハイパス・フィルターが適用されます。これは強いグレースケール勾配(氷の厚さなどに依存)が顕微鏡写真にかかっているときに役立ちます。)

 ● Pixel size in references (A): 3.54

(負の値を渡した場合、入力した顕微鏡写真と同じスケールであると認識します。そうでない場合、例えば粒子を抜き出す上でのリファレンスを作るために使用される粒子をリスケールする必要があるので、正しいピクセルサイズの正の値をここのリファレンスに追加します。【particle extraction】jobで4倍の粒子(256から64)をダウンロードするため、参照のピクセルサイズは4*0.588=3.54Åです。)

 ● Mask diameter (A): -4

(負の値を与えた場合、(【2D classification】 jobタイプのときに使った値と同じ値が使えます。)

 ● Angular sampling (deg): 5

(この値はどんな場合でもほとんど正常に動くと思われます。)

 ● References have inverted contrast? Yes

(顕微鏡写真の中にある粒子は黒い(CTF補正がかかっていない)ので、使用するリファレンスは白を利用します。)

 ● Are References CTF corrected? Yes

(2Dクラス平均を行った際にCTF補正をしたためです。)

 ● Ignore CTFs until first peak: No

(【2D classification】jobでもリファレンス作製のために使用した場合のみこのオプションを使って下さい。)

【auto piking】タブでの設定:

 ● Picking threshold: 0.8

(これはpeak-searchアルゴリズムのためのFOMマップ中のしきい値です。この値よりも低いFOMの粒子は検出されません。)

 ● Minimum inter-particle distance (A): 200

(これは、隣接する2つの粒子間の最大許容距離です。反復的クラスタリングアルゴリズムはこの距離よりも互いに近い粒子を取り除きます。これの効果的な値は粒子直径の50%から60%の範囲であることが多いです。)

 ● Maximum stddev noise: -1

(これは炭素領域や非常に汚染されてる特徴が見て取れる領域のピッキングを防止するのに有効です。標準化された顕微鏡写真のバックグラウンド標準偏差がこの値より高い領域のピークは無視します。効果的な値は1.0から1.2の範囲であることが多いです。バックグラウンド標準偏差が高いため、ピークを除去するためにこの機能をオフにするには値を-1にして下さい。)

 ● Minimum avg noise -999

(これは炭素領域や非常に汚染されてる特徴が見て取れる領域のピッキングを防止するのに有効です。標準化された顕微鏡写真のバックグラウンド標準偏差がこの値より高い領域のピークは無視します。効果的な値は-0.5から0の範囲であることが多いです。バックグラウンド標準偏差が高いため、ピークを除去するためにこの機能をオフにするには値を -999にして下さい。)

 ● Write FOM maps? Yes

(下の説明参照。)

 ● Read FOM maps? No

(下の説明参照。)

 ● Shrink factor: 0

これを0に設定することで、オートピッキングプログラムは顕微鏡写真をリファレンスにおいてのローパスフィルターの解像度にまで縮小します。これはチュートリアルを手軽にできるように、実行をとても速く、要求メモリも軽くしてくれます。0から1の間の値は顕微鏡写真のサイズの画分の結果になります。これはshrink=1(縮小しない)にするよりもいくらか正確さの低い検出になるということに注意して下さい。これの新要素についての詳細な説明は次のサブセクションでします。)

 ● Use GPU acceleration? Yes

(適切なGPUを備えている場合のみ使って下さい。)

 ● Which GPUs to use:

(これを空白のままにした場合、このプログラムはどのGPUを使えばよいのか判断しようとします。しかし、もし使いたいGPUのIDが例えば0や1などと、はっきりと分かる場合は、この項目に入力して下さい。複数のMPI-processorsを使う場合(そうでない場合も)は、それぞれのMPI processを特定のGPUで動かすことができます。それぞれのMPI processesに割り振るGPU IDは0:1:0:1など、コロンで分けられています。0:1:0:1とはMPI processの0と2はGPU 0上を、MPI processの1と3はGPU 1上で動作しているという意味です。)

【Helix】タブは無視して下さい。 【Running】タブでひとつのMPI processorを使って動かして下さい。おそらくoptimise_paramsのようなエイリアスが有効かもしれません。GPUアクセラレーションを使うと、ジョブは30分で完了します。

この計算の高負荷な部分は、a probability-based figure-of-merit(それぞれの回転したリファレンスと顕微鏡写真の中の全ての場所での相互相関関数に関連した値)の計算をすることです。計算後には、前述のしきい値と最小距離のパラメータを利用した、より高速なpeak-detectionアルゴリズムが実行されます。これらのパラメータは最適化する必要があるため、 プログラムは【References】タブで指定されているようにいわゆるFOMマップをかき出します。これらはリファレンスごとに2つの大きなサイズ(顕微鏡写真のサイズ)のファイルになります。ハードディスク動作中のI/O障害を避けるために、FOMマップに書き出すときに自動検出プログラムは順次に動作するようにできます(従って上記で示した様に、一つのMPI processorで実行するべきです。)

FOMマップをディスクに書き出せば、より高速に検出するパラメータになるように最適化するために使用されます。最初に、動作させ終えたばかりのjobで【Display:】ボタンから coords_sufix_autopick オプションを使って、現在の設定で自動検出された粒子を調べます。ディスプレイウィンドウは、最後に実行した【Manual picking】jobのパラメーター(サイズやシグマコントラスト、カラーなど)を利用することに注意しておいて下さい。実際に【Manual picking】jobタイプでこれらのパラメーターを変更でき、左上の jobs メニューから Save job settings オプションで設定を保存できます。

FOMの状態を表示するために、【Colors】タブで次のように設定したあとに、これを行って下さい。

 ● Blue<>red color particles? Yes
 ● MetaDataLabel for color: rlnAutopickFigureOfMerit	
 ● STAR file with color label:

(この部分は空にしておいて下さい。)

 ● Blue value: 1
 ● Red value: 0

【Running】タブでjobを実行すると、従来通り【pick】ボタンと、【CTF】ボタンをもつ同様のGUIが示されます。ディスプレイウィンドウから両方の顕微鏡写真を開き、より多くのまたはより少ない粒子を選びたいか(つまり、しきい値を大きくするか小さくするか。)近くの粒子を同一とするか異なるものとするか決定します。(最小の粒子間距離の設定)各粒子が赤から青に着色されていることに注意してください。(赤のFOMはとても低く、青のFOMはとても高いです。)次のステップに進む間、両方の顕微鏡写真のディスプレイウィンドウを開いたままにすることができます。

【Finished jobs】から、AutoPick/optimise_params jobを選択して下さい。そして【autopicking】タブ上でパラメーターを変更して下さい。次のように変更して下さい。

 ● Write FOM maps? No
 ● Read FOM maps? Yes

【Continue now】ボタンをクリックすることで実行した時、全てのFOMの再計算の代わりに、以前書きだされたFOMマップをディスクから再読み込みします。新しい座標のその後の計算は、数秒で実行されます。

3つのパラメータをすべて使いこなして、検出結果をどのように変更するかを確認してください。すべての顕微鏡写真のauto-pickingに使用するパラメータがわかったら、GUIの左上にあるjob-typeブラウザの【Auto-picking】オプションをクリックして【Run now!】ボタンでjobを選択します。【I/O】タブで入力した顕微鏡写真のSTARファイルと選択した2つの顕微鏡写真を元の【CTF estimation】job のところで置き換えます。(CtfFind/job003/micrographs_ctf.star)【References】タブに表示されている通りすべて任せます。また、【auto picking】タブは以下のように設定します。

 ● Picking threshold: 0.0
 ● Minimum inter-particle distance (A): 100

(良い値はしばしば、粒子の直径のおよそ50-70%です。)

 ● Maximum stddev noise: -1
 ● Minimum avg noise: -999
 ● Write FOM maps? No
 ● Read FOM maps? No

ここで、jobは並列に(FOMマップが書き出せされてないのであれば)実行されるかもしれません。【Running】タブで、自動検出を実行するコアの数を指定します。MPIプロセッサーの最大有効数は、入力したSTARファイルの顕微鏡写真の数となります。シグナルMPIプロセスとシグナルGPUのみを使用して、計算はまだ約1分で終了しました。エイリアスとしてtempale_basedを使用しました。

FOMマップを読み込み書き出しをするかどうかによって、【Continue now】ボタンの動作の仕方に重要な違いがあることに注意して下さい。FOMマップを読み込みまたは書き出しをする場合には、【Continue now】ボタンをクリックすることで、プログラムは(一般的には少数の)全ての入力した顕微鏡写真を再度検出します。しかし、FOMマップの読み込みまたは書き込みをしない場合、すなわち、自動検出を全ての顕微鏡写真で行う2回目のjobでは、【Continue now】ボタンをクリックすることで、まだ自動検出を行っていない顕微鏡写真のみ再検出します。これはスケジュール化されたjobの反復にて有効です。たとえば、顕微鏡検査セッションの間の高速データ処理などです。また、詳細は13.3のセクションを見て下さい。もし再検出を全ての顕微鏡写真について、新しい値のセットを用いてしたい場合は(仕上がっていない顕微鏡写真だけ動作させる代わりとして)、【Run now!】ボタンの代わりに、左にあるjobタイプブラウザ上で【Auto-picking】jobタイプをクリックして下さい。そのとき、新しい出力ディレクトリが作成されます。 【Display:】ボタンからcoords_suffix_autopick オプションをクリックすることで、結果を再確認することができます。手動で全ての顕微鏡写真を調べて誤検知を取り除くのを好む方もいます。たとえば、顕微鏡写真上の炭素端や高コントラストの人工物はしばしば粒子と誤認されます。【Display:】ボタンからポップアップウィンドウを使うことで、それぞれの顕微鏡写真においてこれを実行できます。マウスの中ボタンを使って粒子を取り除いて下さい。中ボタンを押しっぱなしにすることで、広い範囲の誤認粒子を複数取り除けます。忘れずに右ボタンメニューから新しい座標を保存して下さい。

ひとたび全部の結果を満たしたすと、ディスクスペースを確保するために、最初のステップで書き出したFOMマップを削除したくなるかもしれません。手軽に行うために【Job actions】ボタンから、Gentle clean オプションを使うことができます。 ひとたび座標全体セットを満たしたら、以前のデータを全て保ちつつ、【Partcle extraction】jobを再実行する必要がありますが、【Input coordinates】を自動検出で新しく生成されたものに変えて下さい。これは下記のよりよい精密化のために使われる初期単粒子データセットを作成します。おそらく、template_basedのようなエイリアスは意義があるのでしょう。

1.9.1The shrink parameter(縮小値)

より速い処理を可能にするために、RELIONでは、コマンドライン引数 --shrink を通して顕微鏡写真をフィルタリングするオプションを実装しています。最もシンプルな使い方は --shrink 0 と使うことです。しかし、これはもっと制御して使うことができます。その場合は、次の方法に従って動作して下さい。

--shrink の初期値は1.0ですが、これは効果がなく、顕微鏡写真に全くフィルターをかけません。これは以前のバージョンのRELION-2.0の自動検出と同一の動作をします。

● --shrink val = 0 では、テンプレートリファレンスのローパスと同じように、--lowpass 指定されたローパスフィルタをかけた顕微鏡写真となります。これは単粒子解析(らせん状検出のためではなく)のために使うことをお勧めします。

● --shrink 0 < val ≤ 1 では、画像サイズが、size= val ·micrograph size にした結果になります。すなわち、valとは顕微鏡写真のオリジナルサイズに適用させたスケールファクターです。

● --shrink val > 1 では、size = val − (val mod 2)、すなわち、valより小さい最小の偶数の整数値になります。これは顕微鏡写真に特定の(偶数の)整数サイズ与える方法です。

新しいサイズが--lowpassよりも小さい場合、これは要求された(あるいは初期設定の)分解能を超えて、分解能を制限することになるので、致命的ではありませんが警告をならす結果となります。RELIONの自動検出は多くのFFTを実行するため、顕微鏡写真のサイズもFFT計算の大きな落とし穴を避けるために自動的に調整されるようになりました。これらに関する注釈とどのようにパラメータが上書きされるかは、ユーザーが実行する各自動検出の最初の出力に表示されます。

1.10 Particle sorting(粒子ソート)

RELIONには、各粒子とそれらの調節されたCTF補正リファレンスとの間の差異に基づいて粒子を素早く並べ替える機能もあります。ソートプログラムは【Particle sorting】jobタイプからアクセスすることができ、それぞれの粒子でリファレンスが利用できるときであれば、いつでも動かせます。たとえば、【Auto-picking】、【2D classification】、【3D classificationo】、【3D auto-refaine】の後などです。その使用方法を示すために、自動検出の後に実行します。

【I/O】タブでは以下のように設定してください。

 ● Input particles to be sorted: Extract/allmics autopicked/particles.star

(このファイルは自動検出後の抽出プログラムによって生成されます。【2D classification】、【3D classification】または、【3D auto-refine】jobの場合は、最後の反復での_data.starを入力するべきです。)

 ● References from model,star:

(空のままにします。これは入力粒子が【2D classification】、【3D classification】または、【3D auto-refine】jobからくるときに利用されます。)

 ● OR autopicking references: Select/templates4autopick/class_averages.star

(抽出された粒子のための座標を与える自動検出jobに使われた参照を入力してください。)

【CTF】タブ上では以下のように設定してください。

 ● Pixel size in references (A) -1

(参照はソートされる粒子と同じサイズです。)

 ● Are References CTF corrected? Yes
 ● Ignore CTFs until first peak? No

このプログラムは、シグナルMPIプロセスにおいて数秒で実行されます。複数のMPI processorsを動かす必要がないほどです。おそらくあなたはエイリアスとしてafter_autopickを使うことができると思います。このjobは出力ディレクトリに particles_sort.star と呼ばれる入力ファイルと同じファイルを生成しますが、rlnPartileSelectZScore と呼ばれるカラムの追加があります。。【Subset selection】jobタイプの 【OR select from particles.star】 とある行で、このファイルを選択することが出来ます。すべての粒子を表示するために必ずGUIの‘Max. nr. images’ エントリーを負の値に設定してください!ポップアップ表示ウィンドウ内にて、その新しいカラムに基づいて粒子を可視化できます。ディスプレイの上に良い粒子、下に良くない粒子をもつ強い傾向が見えてきます。下から上にスクロールして、下のすべての粒子を破棄する必要があるポイントを決定でき、右マウスメニューを使用して Select all above および、または1つずつ粒子を選択することができます。右マウスからポップアップメニューを使って、出力STARファイルに忘れずに保存しましょう。おそらく、after_sortingのようなエイリアスがこの【Subset selection】jobに役立つことでしょう。

 3.0のリリースから、RELIONはSTARfileの値に基づいて粒子のサブセットを選択するためのGUIベースの機能も実装しています。これはソート後の粒子の整理にも役に立ちます。もしデータセットが非常に大きい場合は、それらをすべて表示するのに長い時間と多くのコンピュータのメモリがいります。したがって、【Particle sorting】jobは、logfile_pdbも出力し、ソートアルゴリズムとそれらのヒストグラムから、すべての粒子のZスコアをプロットします。一度これらを見て、Zスコアのカットオフにとって良い値を決めることができます。これはチュートリアルで行わなかったと思いますが、それから【Sub selection】guiに行くことができます。【I/O】タブでparticles_sort.starファイルを読み込み、【Subset】タブで設定してください。

 ● Select based on metadata values? Yes
 ● Metadata label for subset selection rlnParticleSelectZscore
 ● Minimun metadata value: -9999.
 ● Maximum matadata value: 8.0
 ● OR: select on image statistics? No
 ● OR: split into subsets? No

2 Reference-free 2D class averaging (参照無2次元クラス平均)

良くない粒子を取り除くために、大抵は参照なし2Dクラス平均を使います。 前項で述べた粒子抽出ステップ(例えば、自動検出結果の手動管理や抽出された粒子の分類)で良い粒子を含もうとしますが、ほとんどの場合、良くない粒子がデータの中にまだ存在しています。 良くない粒子は一緒にうまく平均化しないので、大抵は比較的小さいクラスになりやすく、不適切な2Dクラス平均を算出します。これらを取り除くことで効率的にデータをきれいにします。


2.1 Running the job(動作の実行)

このチュートリアルでは動作タイプを【2D classificiation(2次元分類)】にセットし、その中の【I/O】タブは次の通りにセットします。その他のオプションは、前述の自動検出のテンプレートを作成した時と同じです。

●Input images STAR file: Select/after_sorting/particle.star

【Optimisation(最適化)】タブを次の通りにセットします。

●Number of class: 100

(今、たくさんの粒子を持っています。)  After_sortingのようなエイリアスを用いると、20分ほどで終わります。 動作が終了したら、_model.starファイルを選択して【Subset selection】を起動することができます。class2d_aftersortのようなエイリアスは意味があります。ここで、すべての見栄えの良いクラスをクリックして選択します。(もしくは右クリックメニューオプション【Select all classes above】を使用する。)この時、自動検出において低いしきい値を使用して、高解像度のノイズが蓄積している場合、低解像度のゴーストのように見える【Einstein-from-noise】クラスに気を付けてください。こうしたクラスの選択は避けて下さい。より良いクラスがすべて選択されたら、マウス右クリックメニューオプションから選択したものを保存します。 この手順は、複数回繰り返すことがあるので、覚えておきましょう。また、2D classficationのあとのデータに残っている外れ画像を識別するために、ソート(並べ替え)アルゴリズムを再実行できることに注意してください。 す

2.2 Analysing the results in more detail(より詳細な結果の分析)

ここではRELIONへの興味が深い人向けの、より詳細な情報を含んでいます。 お急ぎの方はこのセクションをスキップしても構いません。 RELION は 2D(3D)classification を繰り返すごとに、ファイルに書き出します。 2D クラス平均算出の最終反復時では、以下のファイルが作成されます。

● Class2D/after_sorting/run_it025_classes.mrcs 

 これは、クラス平均結果をMRCスタックとして保存しています。これらはメインGUIのDisplay: ボタンから _model.star を選択したときに表示される画像です。RELION は GUIから選択した場合、(GUIを選択した場合)、クラス平均はおそらく黒い背景が白くなるだろう。そのためクラス平均はおそらく黒い背景に対して白いものになります。もしデータが良ければ、その画像はローパスフィルターをかけた原子モデルにとてもそっくりな投影になります。 2D クラス平均の質は3Dマップがうまくいくかどうかの指標になります。我々はタンパク質ドメインの投影を用いた内部構造と、理想的には平らになっているであろう粒子周りの溶媒領域を期待したいところです。  溶媒領域の放射状に伸びた筋は典型的な過剰適合の兆候です。もしこれがおきたときは、2D classification アルゴリズムのE-step内で分解能に制限をかけてみて下さい。

●Class2D/after_sorting/run_it025_model.star 

 これは実際のクラス平均に沿って精密されたモデルパラメーター(クラス間の画像の分布、再構成された構造中のシグナル対ノイズ比の球面平均、全てのグループのノイズスペクトラム)を含んでいます。  less コマンドを使って、このファイルの中身を見てください。特に、data_model_classesテーブルのそれぞれのクラスの粒子分布を確認して下さい。これとクラス平均を比較すると、低分解能のクラスにある粒子はほとんどない一方で、高分解能のクラスに存在する粒子は多いと分かる。  平均的に少ない粒子を通しての平均化は自然と低いシグナル対ノイズ比になりますので、このときにベイズ推論的な考えを持つことが重要になります。それぞれのクラスにおいて概算されたスペクトラル、シグナル対ノイズ比はdata_model_class_N テーブルに保存されます。同様に、それぞれのグループにおいて概算されたノイズスペクトラムはdata_model_group_Nテーブルに保存されます。data_model_groupsテーブルはそれぞれのグループにて精密されたscale-factor強度を保存します。(平均よりも高い値をもつグループはより強力なシグナルを持っている、平均よりも低い値をもつグループは相対的に低いシグナルである)  これらの値はデフォーカスと相互関係があることが多いだけでなく、汚れのの蓄積や氷の厚さに影響される。

●Class2D/after_sorting/run_it025_data.star

 これはそれぞれの粒子に関わる全てのメタデータを含んでいます。そのメタデータとは、particles.star fileに入力した情報の他に、最適な方向、最適なクラス同定、対数尤度への寄与、などに関する追加情報です。 このファイルは再度新しく洗練されたデータをstarファイル同様の形式のでの入力に使用される。

●Class2D/after_sorting/run_it025_optimiser.star 

 これは終了しなかった場合の再起動に必要な精密化過程についての全体的な情報が含まれています。たとえば、もし25反復後でもまだ収束しなかった過程を考える場合(評価のために反復24と25から出したクラス平均を比較できる)、Finished jobs パネルの中で以下の機能を選択できる。I/O タブ上で、Continue from hereから上記のファイルを選択することが出来る。そのときに、Optimisationタブ上で

Number of iterations:40 

と設定して下さい。このジョブは、反復26から反復40名で繰り返されるだろう。また、Sampling タブで緻密な角度や並列処理をするサンプリング比率を選ぶかもしれません。optimiser.starファイルのもう1つの有用な特徴として、1行目に、これを動かすために与えられた正確なコマンドライン引数がコメントとして含まれています。

●Class2D/after_sorting/run_it025_sampling.star 	

 これはサンプリング間隔の採用についての情報が含まれています。このファイルもまた再起動に必要なファイルです。

2.3 Making groups

ここではRELIONへの興味が深い人向けの、より詳細な情報を含んでいます。 お急ぎの方はこのセクションをスキップしても構いません。

RELIONは、粒子をグループ化する際に、以下のふたつのことを実行します。ひとつは、平均のノイズのスペクトラム強度(σij^2)の推定と単一数としての強度スケールファクター(τi^2)の推定です。後者は、そのデータの異なる部分の間での、全領域シグナル対ノイズ比(SNRi)の違いを表現しており、例えば、氷の厚さ、デフォーカスまたは汚染等によるものです。  通常、顕微鏡写真上の全ての粒子は別々のグループとして扱っています。この動作は顕微鏡写真ごとに多くの粒子が存在する場合には良いです。しかし、高倍率で扱っている場合、サンプルは非常に希釈されるか、最終的に選択されたものは顕微鏡写真ごとには少数しか粒子が含まれておらず、強度スケールファクター(またノイズスペクトラ)強度の推定は不安定なものとなります。一般的に各グループに少なくとも10〜20の粒子がある方が良いとしていますが、2D,3Dクラス化後、各グループの粒子の初期数はより少なくなるだろうということに注意しておいて下さい。  顕微鏡写真ごとに粒子が殆ど無い場合、複数の顕微鏡写真からの粒子をグループ化することをお薦めします。このことから、RELION 2.0での新しいGUIとして【Subset selection】の中に便利な機能が追加されています。それは【I/O】タブ上で _model.starファイルを選択した時、【Regroup particle?】と表示された時【Yes】と入力し、【Approximate nr of groups : 5】と【Class option】タブで入力することで、すべての粒子を5つのグループに分類できます。(実際の数は入力値によって幾分変化するため、入力上での近似値となる)この方法は以前の最終バージョンのRELIONでは避けられた方法でした。このチュートリアルの顕微鏡写真には十分な粒子が含まれているので、ここではこの手順を使用しません。 RELIONは、他のプログラムで時々使用されるデフォーカスグループとは非常に異なることに注意しておいて下さい。RELIONは常に各粒子に使用されたグループとは無関係に(異方性の)CTF補正がされます。

3 De novo 3D model generation  (3Dモデル形成)

RELIONは、2Dの粒子から| 3D initial model | (3Dの初めのモデル)を生成することからSGDアルゴリズムを用いる。RELION-3.0によると、実行はcryoSPARCプログラムの実行にとてもよく従う。見ている方向とデータの合理的な配分の生成は(2D classification)の詳細なクラス平均を産出するために十分いい。このアルゴリズムは、適切な産出にとてもふさわしく、それ以降の低解像度モデルは、3D classificationか3D auto-refunementで利用できる。ここで留意すべきは、リリースされた3.0の実行の改善は、もはや2D classification動作からクラスにつき選択されたランダムな分子とともに分子の部分集合を選択することをしないことである。代わりに、選択された分子の一式の全体のデータを用いた時、そのアルゴリズムはとてもたくましいものである。

3.1 Running the job (動作の実行)

3D initial model のジョブタイプのI/Oタブのselect/class2d_aftersort/particles.starファイルを選択する。すべては、すでにCTFで順番にしている。OptimisationタブのFillにより従う(角のある初期状態の放置とサンプリングの相殺)

●Number of class : 1

(時々、一つのクラスより大きいもの。0をつかうと、データセットにまだ存在するだろう至適な分子のシンクの生成を助けるだろう。追加された議論sgd_skip_annealはまだ有用だろう。この場合、私たちはスピードアップするための一つのクラスをつかうだろう。)

●Mask diameter (A) : 200

前と同じ

●Flatten and enforce non-negative solvent  : Yes
●Symmetry C1

(対称性がなにかもわからないとき、C1の再構築はおそらく、始めることにベストな選択であるだろう。いくつかの高い対称性の物体は正しい空間グループよりC1のSGDによる解法が簡単だろう。このデータセットはいいデータで、正しいポイントグループD2が動作できる。しかしながら、C1からC2にどのように進行するかを説明すると、C1のSGDを動かすだろう。) 特に、実例の1つに、SGDタブのいくつかに変えることはできないことと、その初期状態はいくつかの場合に適している。しかしながら、このチュートリアルのスピードアップすることは、私たちは、反復のデフォルトの数の半分だけ行うだろう。 したがって、このように変化する。:

●Number of initial iterations : 25
●Number of in-between iterations : 100
●Number of final iterations : 25

Gomputeタブで、システム上で最適化する。再度RAMの中で数千の分子がプレリードできる。GPUの加速は、スピードアップを実現でき、反復の間の複数の極大化のステップは、2Dか3Dの精密化か分類の基準の準備はゆっくりになるだろう。4CPUのカードと、5MPInoプロセス、6スレッドのMPIプロセスを使い、システムはおよそ15分で済む。

3.2 Analysis the result (結果の分析)

UCSFキメラのような3Dビューワーの吐出量(Initial Model/job017/run-it/50_class001.mrc)を見る。もし、このポイントにおける対照的なポイントグループの追加を認識することは、RELIONの習慣における協調的なシステムの中心的なX,Y,軸における対照的な軸を整列させることを必要とするだろう。リリースされた3.0は新しいプログラムを促進することを含む。 この動作はコマンドラインから実行できる。

●Relion_align_symmetry - - i InitialModel/job017/run_it150_class001.mrc - -o InitialModel/job017/run_it150_class001_alignD2.mrc - -sym D2

それと、マップにおける対照的な軸のUCSFキメラかrelion_displayの確認はX,YとZ軸の実際の整列とする。私たちはD2の対称的なものを使うことを強要させるだろう。

●Relion_image_handler –i InitialModel/job017/run_it150_class001_alignD2.mrc –o InitialModel/job017/run_it150_class001_symD2.mrc –sym D2

後者のコマンドの出力マップは、入力マップに似ているだろう。 これによって確認できる。

●relion_display_ --i InitialModel / job017 / run_it150_class001_alignD2.mrc & relion_display –i InitialModel / job017 / run_it150_class001_symD2.mrc &

4 Unsupervised 3D classification (教師無3次元クラス分類)

すべてのデータは異性分からなっています。問題は、どのくらいの費用でいられるかです。RELIONの3Dマルチリファレンス精密化手順は、強力な教師なし3次元分類へのアプローチを提供しています。

4.1 Running the job (ジョブを開始)

教師なし3次元分類は、[3D classification] ジョブタイプから、実行可能です。 [I/O]タブの設定:

●Input images STAR file: Select/class2d_aftersort/particles.star
●Reference map: Import/initial_3dref/3i3e_lp50A.mrc

このマップはパイプラインの部分のように、Brouseボタンで表れないように述べる。両方のタイプは空のフィールドの中に名付けられるか、importジョブタイプをつかうマップの移入が行われる。対照的なC1を動作させたり、非対称的なInitialModel / job017 / run_it150_class.mrcを使いことを選択する。しかしながら、すでに右の対称的なセッティングは、後々とても楽になるだろう。

●Reference mask (optional):

(これは空白のままにしておきます。これは、例えば、注目しているリボソーム精密化のために大/小サブユニットマスクを提供するところです。この項目を空のままにしておくと、[Optimisation]タブで指定された粒径の球形マスクが使用されます。 これは分類へのバイアスを最小限にする働きがあります。) [Reference]タブの設定:

●Ref. map is on absolute greyscale: No

(このマップがデータセットから再構築されたとき、すでに正しいグレースケールであります。RELION内の同じデータから再構築されていないマップは、おそらく、正しいグレースケール上にないと考慮しておきましょう。)

●Initial low-pass filter (A): 50

(精密化プロセスにバイアスが導入する可能性があるため、高解像度の初期参照モデルは使用してはいけません。[12]で説明したように、初期マップをできる限りフィルタリングする必要があります。リボソームでは大抵、70Åを使用し、小さい粒子では通常40〜60Åの値を使用します。)

●Symmetry: C1

(このサンプルはD2の対称性があることはわかっていますが、対称性を持たない初期分類を実行することをお勧めします。良くない粒子は適切なものから分離することができ、対称性は再構成されたマップで確認することができます。)

●Do CTF corection? Yes
●Has reference been CTF-correced? Yes

(このモデルは、SGDのCTFコレクションによって作られている。)

●Have data been phase flipped? No
●Ignore CTFs untill first peak? No

(リファレンスを作成するために使用した[2D classification]jobでもこのオプションを使用した場合にのみ、このオプションを使用します。) 【Optimisation】タブの設定:

●Number of class: 4

(より多くのクラスを使用すると、多様な情報が含まれているデータセットがより多くのサブセットに分割されます。計算コストは、CPU時間と必要なコンピュータメモリの両方の観点から、クラス数に比例して変化します。)

●Number of iterations: 25

(これは一般的には変更する必要はありません。)

●Regularisation parameter T: 4

(Tの定義については[13]を参照してください。クライオEMの、2次元分類では、通常、Tは1~2を設定し、3次元分類では2~4を設定します。ネガティブ染色の場合、少し低い値が効果的な時があります。クラス平均にノイズが見える場合はTの値を低くし、逆にクラス平均の分解能が低すぎる場合はTの値を高くします。主に気をつけなければならない点は、高解像度のノイズの過学習です。あらかじめ計算された結果に2という値を使用しました。おそらく4を設定しても同じようにうまくいくでしょう。)

●Mask diameter (A): 200

(前回の[2D classification]のjobタイプと同じ値を使用してください。)

●Mask individual particles with zeros? Yes

(Yes: 0 / No: 乱数)

●Limit resolution E-step to (A): -1

(正の値を指定すると、この値を超える周波数はアラインメントに含まれません。これは過学習を防ぐのにも役立ちます。実際に必要にではありませんが、10~15Aに設定されている可能性があります。) 【Helix】タブは無視して下さい。 以前の[2D-classification]の場合と同様に【Compute】タブに記入してください。 ここでも、【Running】タブで、使用するNumber of MPI processors(MPIプロセッサの数)とthreads(スレッド数)を指定できます。[2D classification]のjobタイプで説明したように、3次元分類は2次元分類よりも多くのメモリを必要とするため、より多くのスレッドが使用されることがあります。しかし、この場合、画像はかなり小さく、RAM不足はそれほど大きな問題ではないかもしれません。おそらく、最初の3次元分類を表示するためにfirst_exhaustiveのようなエイリアスを使用でき、徹底的な角度検索を使用しているのではないでしょうか。 精密化された再構成を分析する際には、UCSFキメラなどのしきい値マップだけでなく、スライスでそれらを見ることも非常に便利です。スライスビューでは、未解決の異質性のより良い印象を受けるでしょう。これは、スライスに不鮮明な領域や縞状の領域として表示されます。スライスはまた、溶媒領域の平坦性の良好な印象を確認できます。【Display:】ボタンを使用して、最後の反復からの再構成のいずれかを選択して、RELIONのスライスビューを開きます。 UCSFキメラなどを使用し、表示されたマップを3Dで見ると、マップが精密化の間にわずかに回転する可能性があるので、それらをすべて最良のものに合わせることはしばしば良い考えです。キメラでは、【Tools】 - > 【Volume Data】 - > 【Fit in Map】ツールを使用します。お互いに並んでいる複数のマップを見るには、【Tools】 - > 【Structure Comparison】 - >【Title Structures】ツールと、【Viewing】ウィンドウの【independent】中心回転方法を組み合わせたものが好ましいです。 2次元分類の場合と同様に、【Subset selection】を使用して、1つ以上のクラスに割り当てられた粒子のサブセットを選択することができます。【I/O】タブで、_model.starファイルのサブセットを最後の反復から選択します。表示ウィンドウには、4つの精密化されたモデルの中央スライスが表示されます。最適なクラスを選択し、右クリックメニューを使用して対応する粒子を保存します。class3d_first_exhaustiveのようなエイリアスを使用してください。

4.2 Analysing the results in more detail (詳細な結果の解析)

ここではRELIONへの興味が深い人向けの、より詳細な情報を含んでいます。 お急ぎの方はこのセクションをスキップしても構いません。

出力ファイルは基本的に2次元分類の実行時と同じです。(実際に2次元,3次元精密時に同じ記法を利用しています)唯一の違いは、以前に出力された2次元クラス平均に関するシングルMRCスタックとは対照的に、各クラスのマップが別々のMRCマップとして保存されることです。例えば、run_it025_class00?.mrcというMRCマップです。 今まで通り、小さいクラスは大きなクラスより精密にローパスフィルターにかけられ、スペクトルのシグナル対ノイズ比(SNR)が_model.starファイルのdata_model_class_Nテーブル(N = 1,,,,K)に保存されます。おそらく今がSTARファイルから任意のタイプのデータを抽出するのに便利な2つの手軽なスクリプトを導入するいい機会です。以下の通りに入力して下さい。

●relion_star_printtable Class3D/first_exhaustive/run_it025_model.star data_model_class_1 rlnResolution rlnSsnrMap

上記はdata_model_class_1テーブルから解像度に関する(rlnResolution)コラムとスペクトルのシグナル対ノイズ比に関する(rlnSsnrMap)コラムを画面に出力します。ここでそのファイルを参照して、お好みの言語でプロットできます。もし、使用者のコンピューターにgnuplotがインストールされているのであれば、以下の通りに入力して下さい。

●relion_star_plottable Class3D/first_exhaustive/run_it025_model.star data_model_class_1 rlnResolution rlnSsnrMap

実行が収束したかどうかを確認するには(上記のように)、以下でも確認できます。

●grep _rlnChangesOptimalClasses Class3D/first_exhaustive/run_it???_optimiser.star

これまででお分かりのように、STARファイルはさまざまなタイプの入出力データを扱うのに非常に便利なツールです。得られた結果の分析するための柔軟で強力なツールとなるrelion_star_printtableのようなスクリプトは、だいたいgrepやawkのようなlinuxのシェルコマンドと併用して実行できます。

5 High-resolution 3D refinement(三次元精密化)

十分に均質なサブセットは一旦選択されると、このサブセットを自動的に高い解像度に精密化するために[3D auto-refine]を使用することができます。この手順は分解能を推定するために、gold-standard Fourier Shell Correlation(FSC)(二つの群に分け、互いに独立して再構成した場合に、どの分解能まで相関があるかにより判断)と言われる判断基準を用います。これにより、過学習を避けることができます[15]。角度の割当の正確さを推定する新しい手順([14])と組み合わせ、精密化が収束するときに自動的に決定されます。そのため、この手順は使用者の入力をほとんど必要としません。すなわち、客観性をのこしたまま、多くのデータセットのための優れたマップが生成がされていると述べられています。もう一つの長所は、一般的にこの手順は必要な実行回数が一回のみであり、最適化のための引数はほとんどありません。  しかしながら、前に高解像度の精密化を始めた時、スケール未満とともに選ばれた粒子の正しいセットを再度抽出して、それによりもしかすると高解像度になるかもしれない。これをすることで、GUIのParticle extraction のジョブタイプとI/Oタブを与える。

●micrograph STAR file : CtfFind / job003 / micrographs – ctf.star

(そのままでよい)

●Coordinate – file suffix : 

(空でよい)

●OR re – extract refined particles ? Yes
●Refined particles STAR file : Select /class3d – first_exhausitive /    particle.star

(今、選択された粒子の微粒にされたサブセットだけをつかうだろう)

●Re – center refined coodinates ? Yes

(3D classificationの動作以上から整列させたオフセットに従ってすべての粒子は再度中央に置かれるだろう)

●Recenter on – X , Y , Z (pix) 0.0.0

(箱の真ん中の分子を中心にキープさせたい)

●Manually set pixel size ?  No

(入力したマイクログラフstarファイルはCTFの情報に含まれていないことが必要である。) Extractタブはすべてキープする。

●Particle box size (pix) 360

(大きな箱をつかうだろう。それにより非局在化させたCTFシグナルはより良いモデルになるだろう。これはCTF精密化の後が大事である。)

●Rescale particles ? yes

(とても大きな画像が働くことを防ぐことで、360×0.885/256 = 1.244 Åのピクセルサイズを減少させ、採取しましょう。これは、おそらく十分に小さいデータ、2.5 Åの大きな達成可能な解像度に制限があるだろう。) この動作では、エイリアスbest3dclass_bigboxを使用する。 加えて、256ピクセルのボックスサイズに従って一番いいマップを入手したことのいたずらは必要である。

●relion_image_handler –i Class3D/job018/run_it025_class001.mrc –angpix 3.54 –rescale_angpix 1.244 –o Class3D/job018/run_it025_class001_box256.mrc –new_box256 

5.1 Running the auto-refine job (自動精錬動作の実行)

3D auto-refine のジョブタイプのI/Oタブ

●Input images STAR file : Extract/best3dclass_fullsize/particles.star
●Reference map : Class3D / job018 / run_it025_class001_box256.mrc
●Reference mask (optional)

(からのままでいい) Reference タブ

●Ref. map is on absolute gryscale ?  No

スケール現象の画像の違う標準化によると、正しく絶対的なグレースケールはマップの中に確立しなかった。このオプションの“No”は大事で、精密化の最初の相互作用のグレースケールは正しくなるだろう。

●Initial low-pass filter (A) 50

マップの高い頻度の成分に向かってバイアスを防いだことは低いパスのフィルターから自動精密化され始める。それと解像度から完全に依存された粒子の“gold standard”の維持は、1頭文字より高かった。

●Symmetry D2

(高解像度の粒子の照準は、強要された対称性の粒子の4倍効率的にするだろう) CTFのパラメータで、OpimisationとAuto-samplingタブは、3D classificationと同じでとどまる 【Sampling】タブでの配向性のサンプリング間隔は反復の最初の数回のみ使用されており、ここでのアルゴリズムは収束するまで、角度サンプリング間隔が自動的に細かくなっていきます。したがって、8面体または正20面体対称よりも小さい角度で、全ての精密化仮定でで、一般的に大域探索では、初期値の角度である7.5度のサンプルを使用し、局所探索では1.8度のサンプルから行います。より正確な対称の精密化を行う場合のみ、3.7度でのサンプリングを行い、局所探索では0.9度ごとにサンプリングを行います。 MPIのノードは1つのマスター(他のスレーブを管理するだけのもの)と2つのスレーブ(2つの半分のセットに作用するもの)のセットで分かれているので、奇数のMPI処理装置を使用するのが最も効率が良いです。ナイキスト周波数までのすべての周波数が考慮されているため、必要メモリは最終反復でかなり増加します。従って、使っているクラスターノードのコアと同じ数のスレッドで動かしたいデータセットのボックスより大きいサイズで作られたボックスが必要です。もしかするとafter_first_class3dのようなエイリアスが良いかもしれません。

5.2 Analysing the results (結果の分析)

 出力ファイルは3D classificationを実行したときのものと大部分が同じです。しかし、全てにおけるプログラムの反復では、2つのrun_it0??_half?_model.starと2つのrun_it0??_half?_class001.mrcファイルを書き出します。それぞれデータの半分が精密化されます。収束した場合にのみ、ひとつのrun_model.starとrun_class001.mrcファイルを書き出します(名前に_it0??がありません)。最終反復では、2つの独立した半分の復元データが一緒に結合されているので、一般的に最終反復で解像度がかなり改良されます。プログラムはすべてのデータでナイキスト周波数を使用しているので、この反復では更に多くのメモリとCPUが必要です。 角度サンプリングでの自動増加が自動精密化手順の様子が重要な側面であることに注意してください。[14]で説明されているシグナル対ノイズの考察が基礎となっており、角度の精度と併進運動の割り当てを評価します。プログラムは必要だと判断したものよりも細かい角度や並進運動サンプリング比は使用しません(結果がよくならないためです)。評価された精度と採用したサンプリング比は現在の解像度評価と一緒にすべて_optimiser.starと_model.starファイルに保存されますが、stdoutファイルからも抽出されるかもしれません。 例えば、以下のように試してみてください。

●grep Auto Refine3D/after_first_class3d/run.out

6 Mask creation & Postprocessing(マスク作成 & 後処理)

3D自動精密化の実行後、マップを先鋭化する必要があります。その場合も、自動精密化の内部で生み出されるgold-standard FSCカーブは、マスク化されていないマップのみで使います。(Use solvent-flatted FSCsというオプションを使っていない場合に限ります)これは実際の精密化中には実際の分解能は下回っているということを意味しています。なぜならば、溶媒領域のノイズがFSCカーブを低くするからです。RELIONにおけるBファクターでの先鋭化とマスク化したFSCカーブを計算するための手順は、”post-processing(後処理)”と呼ばれています。しかし、最初にはタンパク質の末端と溶媒領域の開始点を精密化するためのマスクを作る必要があります。これは[Mask Creation]ジョブタイプを使って行います。

6.1 Making a mask (マスクの作成)

[I/O]タブ上で3D自動精密化が終わった出力マップRefine3D/first3dref/run-class001.mrcを選択してください。【Mask】タブ上で以下のように設定してください。

● Lowpass filter map (A): 15

(15Åのローパスフィルターが滑らかな溶媒マスクのために良い選択と思われます)

● Pixel size (A): 1.244

(この値はローパスフィルターの計算にのみ使われます)

● Initial binarisation threshold: 0.005

(これは例としてタンパク質領域の外側にノイズスポットが完全になく表示するキメラのように、ローパスフィルターのかかったマップの描写でのしきい値となります。適切なスポットを見つけるために、しきい値を上げたり下げたりしてみて下さい。入力マップのローパスフィルターがかけられたバージョンを得るために --lowpass 15 --angpix 1.244オプションを付与させてrelion_image_handlerと呼ばれるコマンドラインプログラムを使用できることを覚えておいてください。初期しきい値としてよい値はだいたい、0.01から0.04のあたりです)

● Extend binary map this many pixels: 0

(上記のしきい値は白黒画像マスクを生成するのに使われます。)

● Add a soft-edge of this many pixels: 6

(これはマスクに余弦形状のソフトエッジを配置します。これは、とても鋭いマスクにかなり繊細である可能性があるFSCカーブに、マスクが及ぼす影響を計測する補正手順として重要です。マスクの生成は相対的に速いので、しばしば分解能の最も適した概算を得るためのマスクパラメーターと共に使います。) 【Helix】タブを無視してfirst3Drefのようなエイリアスを使ってください。 3.0がリリースされた現在、このステップを速めるために筋道でmask-createプログラムを実行することができるということを留意してください。[Display]ボタンを使うことでマスクの結果を通した切片を見て、UCSFキメラにマスクを読み込ませることができる。後者はマスクが構造全体をカプセル化するがマスク内に多くの溶媒を残さないことを確認するために自動精密手順のマップと一緒にいいアイデアになるかもしれません。好きなマスクを見つけるまでマスク生成のために新しいセッティングで同じジョブを続けることができます。ジョブを続けるたび、古いマスクはmask.mrc.oldというファイルへコピーされる。

6.2Postprocessing(後処理)

[Post-processing]jobタイプを選択して[I/O]タブで以下のように設定してください。

●One of the 2 unfiltered half-maps:Refine3D/first3dref/run_half1_class_unfil.mrc
●Solvent mask:Mask Create/first3dref/mask.mrc
●Calibrated pixiel size(A):1.244

(時々、正確なピクセルサイズと思って作り始めたモデルが実は数パーセント異なっていたことが分かることがあります。RELION内では、この時までになしたものすべてはまだ一貫しています。そのためマップの再精密化やデータクラスの再分類をする必要はありません。正確なマップと最終解像度の推定のために必要なことがここに正しいピクセルサイズを提供することです。) [sharpen]タブで以下のように設定してください。

●MTF of the detector (STAR file): mtf_k_2_3000kV.star

(RELION wikiに記録した解析結果から2,3個の一般的なカーブをダウンロードすることができます。200kVでのK2のMTFは、300kVでのK2のMTFに似ています。)

●Estimate B-factor automatically:Yes

(この手順は本誌[10]に基づき、最終解像度が確実に10Åを超えるように伸ばす必要があります。もし、マップの解像度が10Åに満たない場合、独自の"ad-hoc"B-ファクターを代わりに使う必要があるかもしれません。)

●Lawest resolution for auto-B fit (A):10

(これは通常変える必要はありません。)

●Use your own B-factor? No

[Filter]タブでは以下のように設定してください。

●Skip FSC-weighting? No

(このオプションのときに全体のマップ分解能を超えるような解像度へと拡張するマップ範囲を解析するのに便利です。今回は当てはまりません。) jobを実行(クラスターは必要ないほどこのjobはすぐ終わります)し、first3drefのようなエイリアスを使用してください。[Display]ボタンを使って、後処理されるマップとこの構造のFSCカーブとGuinierプロットを含んだPDFを通してスライスを表示します。ChimeraでPostProcess/first3dref/postprocess.mrcマップを開くこともできる。そこでは3D自動精密化の手順となる収束したマップでの全てのα-ヘリックスの場所を簡単に見ることができます。分解能の推定は以前に発表された[2]のフェイズランダムの手順に基づいています。フェイズランダムマップのFSC(赤いカーブ)が多かれ、少なかれ、推定していた後処理マップの解像度のゼロ点であることを確認してください。そうでない場合は、マスクが鮮明すぎるか細部の描写が多すぎます。この場合は、強いローパスフィルターや以前の[Mask Creation]ステップでのより広く、より薄いマスクを使用し、後処理を繰り返してください。実際に少し薄いマスクを作りたくなるかもしれないので、その場合は、エッジがだいたい5ピクセルになるように試してみてください。このために[Continue now]ボタンを使った場合、以前の結果が上書きされます。左側にあるjobタイプブラウザをクリックし、[Run now!]ボタンで新しいディレクトリができます。

7 CTF and beamtilt refinement(CTFとビームチルトの精密化)

3.0がリリースされた現在、全体のデータセットのために、粒子につき値とビームチルトの値の焦点をぼかすと見積もるためのプログラムをRELIONは含んでいる。これは、CTFの精密化job-typeでの中で実行されます。これは、相対的に少量の計算量で解像度のさらなる改善を導くことができる。それはPost-processingjobに対応しているのと同様に前の3D auto-refinejobから実行する。

7.1 Runnnig the job(jobの実行)

GUIでCTFrefinement job-typeの[I/O]タブで以下のように設定してください。

●Particles (from Refine3D) Refine3D/first3dref/run_data.star
●Postprocess STAR file:PostProcess/first3dref/postprocess.star

[Fit]タブで以下のように設定してください。

●Minimum resolution for fits (A):30

(デフォルトそのままにします。)

●Perform CTF parameter fitting? Yes

(それぞれの粒子の焦点をぼかす再見積もりに関心があります。これは氷層と氷層の上層や下層にある粒子が水平になっていない原因となるでしょう。)

●Range for defocus fit (A) 2000

(通常デフォルトの数字で問題なく動くでしょう。)

●Fit per-micrograph astigamtism? No

(とても強いデータのみで動きます。)

●Fit per-perticle astigamtism? No

(とてもとても強いデータのみで動きます。)

●Fit per-micrograph phase-shift No

(phase-plate画像でのみ便利でたとえデータが強くなくても扱いにくいだろう。慎重にこれらの結果をモニターしてください。)

●Perform beamtilt estimation? Yes

(全体のデータセットから(XとYの方向の)ビームチルトを見積もります。) このプログラムはCPU上でのみ実行されます。4MPIsを使うことで8つの筋道はそれぞれコンピュータ上でこのジョブはだいたい1分で終わります。

7.2 Analysing the results(結果の分析)

GUI上の[Display]ボタンからlogfile.pdfファイルを選ぶことによって非焦点の精密化を分析できます。水平ではない氷層がどこか顕微鏡写真で見抜くことができますか。ビームチルトの概算はCtfRefine/job024/beamtilt_0.txt;ファイルの中に保存されます。この概算で得られたものからの位相差の画像は表示されて使います。 relion_display --i CtfRefine/job024/beamtilt_delta-phase_per-pixel.mrc --scale 3 & そして表示され、使うことができることを通してモデルはフィットしました。 relion_display --i CtfRefine/job024/beamtilt_delta-phase_lin-fit.mrc --scale 3 & もし、ビームチルトが重要であればこの画像は停止よりもサークルブラッカーの片側とホワイターの片側を示します。この場合、ビームチルトはXでは0mrad,Yでは、0.2mradとおおよそ見積もられました。これらのデータの分析で重要な違いは作りません。ビームチルトの概算なしでCtfrefinement jobを再実行できる代わりに動くために選びました。

8 Bayesian polishing(ベイジアンポリッシング)

3.0がリリースされた現在、ビームによって引き起こされた運動補正をベイジアン法をRELIONも実行します。この方法は規則正しくされた見込みの最適化が狙いです。強いることなしに空間的干渉性の行為と時間的に滑らかな動きが限定する前の見込みで粒子軌道のそれぞれの仮説のセットを連想することを許します。前の期間の平滑度は動きを観察した統計学で説明する3つのパラメータを必要とします。この粒子のデータセットのための最も良い収量の動きを追跡する前の見積もりをすることは最初のtraining modeのプログラムを実行することができます。

8.1 Running in training made(トレーニングモードの実行)

平行な16の筋道を使うことでこのjobはコンピュータで1時間と15分かかります。もしこれを待ちたくないのであれば8.2へ進んであらかじめ計算された結果からsigma-valuesを使うことができます。もし、このjobを実行したいのであれば、job-typeをBaysian polishingを選択して以下のように設定してください。

●Micrographs (from MotinCorr): MotinCorr/own/corrected_micrographs.star

(このMotioncorrection jobはRELION3.0かそれ以上のもので実行されていることは重要です。運動補正について必要なメタデータが書かれていないのでRELION 2.1 もしくはそれ以下ではMotion correction jobは動きません。)

●Perticles (from Refine3D or CtfRefine):CtfRefine/job024/particles_ctf_refine.star

(これらの粒子はポリッシュされます。)

●Postprocess STAR file Postprocess/first3dref/postprocess.star

(このjobからのマスクとFSCカーブはポリッシュの手順で使われます。)

●First movie frame:1
●Last movie frame:-1

(それらの映画から最初もしくは最後のフレームを捨てる人もいます。RELIONでベイジアンポリッシングを行うときこれは勧めないことを注意してください。B-ファクターの映画フレームの重さは光る粒子のシグナルとノイズの割合で自動的に最適化するので、全ての映画フレームを含むための最善です。) [Train]タブにセットして以下のように設定してください。

●Train optional parameters? Yes
●Fraction of Fourier pixcels for testing:0.5

(デフォルトのままにしてください。)

●Use this many particles:5000

(それはほとんどすべてのものです。さらに多くの粒子、多くのRAMでこのプログラムを行うことを留意してください。もし、メモリーが尽きたら、少量の粒子でトレーニングをしてみてください。5000よりもとても少ない粒子を使うのにおすすめしないです。) Polishタブを確かめてセット以下のように設定してください。

●Perform particle polishing? No

このプログラムのトレーニングステップは、MPIと並行しないことに留意してください。それゆえに、1つのMPIの過程のみを使う確認をしてください。プログラムのスピードを上げるため16の道筋でプログラムを実行しました。まだ、計算には1時間以上かかります。trainのエイリアスを使いました。

8.2 Running in Polishing mode(ポリッシングモードの実行)

一度トレーニングステップが終わってしまえば、そのプログラムはPolish/train/opt-params.txtと呼ばれるテキストファイルに書き出されます。粒子をポリッシュするためにこれらのパラメータを使うにはjob-typeメニューの左にある新しいBayesian polishingを選んでクリックしてください。以前と同じ[I/O]タブのパラメータを維持して[Train]タブをトレーニングオフに変換したことを確認してください。その時、[Polish]タブをセットして以下のように設定してください。

●Perform particle polishing? Yes
●Optimised parameter file: Polish/train/opt-params.txt
●OR use your own parameters? No
●Minimum resolution for B-factor fit (A):20
●Maximum resolution for B-factor fit (A):-1

(最後の2つのパラメータはデフォルトのままにしてください。) 代わりにもしトレーニングセットをスキップすると決めたならば、実行することで得たsigma-parametersでPolishタブを満たすことができます。

●Perform particle polishing? Yes
●Optimised parameter file: 

(下記に従って手に入れた最適なパラメータを使うのでここは空のままにしてください。)

●OR use  your own parameters? Yes
●Sigma for velocity (A/dose) 0.462
●Sigma for divergence (A) 1935
●Sigma for accleration (A/dose) 2.46
●Minimum resolution for B-factor fit (A):20
●Maximum resolution for B-factor fit (A):-1

(最後の2つのパラメータはデフォルトのままにしてください。) このプログラム部分はMPI並行化されています。3MPIを使う過程でそれぞれ16道筋、2分で実行し終えます。ポリッシュのエイリアスを使いました。

8.3 Analysing the results (結果の分析)

Bayesian polishing jobは、shuny starと呼ばれる粒子をポリッシュしたSTARfileとlogfileのPDFに出力します。後者はスケールのプロットを含み、放射線障害の重さにため、B-ファクターが使われました。加えて、粒子の精密化のプロットは、全ての顕微鏡写真のすべて含んだ粒子を追跡しています。このデータセットのプロットを見てください。そのステージの流れが少し出現します。ほとんどすべての粒子は映画の間、上の右から左の下へ動きます。ポリッシュ後、粒子のシグナルとノイズの割合は改良されていました。そして、それは新しい3D auto-refine jobと一致するPost-processing jobを提示すべきです。[I/O]タブで下記のオプションを使うため、光る粒子で3Dauto-refineを実行してください。

●Reference mask (optinal): MaskCreate/first3dref/mask.mrc

(これは最初のPost-processing jobのために作ったマスクです。このオプションを使うことで、マスクの外側のすべてのピクセルを0にセットします。これは参考の中でノイズが減少し、このようにさらに良い配向指定を導き、このように再構築します。) [Optmisation]タブ上で下記のように設定してください。

●Use solvent-flattened FSCs? Yes

(精密化は毎相互作用でFSCカーブの基準で溶媒補正を使います。このオプションを良く使うことは、Post-processing job-typeで使われるようです。粒子の箱の中身の相対的に小さい体積をタンパク質が占めるときこのオプションは特に便利です。例えば、分子をとても引き伸ばすかマスクを使って小さい部分で精密化して焦点を合わせるときです。3D精密化でFSCを計算することのデフォルトの方法は精密化の間、分解能は下回っているマスキングしているハーフマップ以外である。これは、毎相互作用でFSCカーブの溶媒補正の位相ランダム化を計算することによって正しく設定され、これは通常注目すべき分解能の改善を導きます。) 以前計算した結果を見ることができるので最終的に2.9Åに伸びている分解能を得ることができます。3GBのデータのために悪くないということですか?

8.4 When and how to run CTF refinement and Bayesian polishing(いつどのようにしてDTF精密化とベイジアンポリッシングを実行するか)

粒子ごとに焦点をぼかしてビームチルトを見積もったベイジアンポリッシングとCTF精密化はともに分解能の再構築を改善するかもしれません。これは最初にどちらを適用すべきなのかという疑問が生じます。この例では、粒子ごとに焦点をずらした値とビームチルトの精密化を最初にしたが、最初にベイジアンポリッシングも行うことができます。両方法とも高い分解能モデルから恩恵を被るので相互作用の手順が有益であるかもしれません。例えば、ベイジアンポリッシングの後、CTFの精密化を繰り返すことができます。通常、初めに最も大きい問題といくつかの試みに取り組むことがおそらく最善です。そして、エラーは場合によっては、必要です。さらにトレーニングが矛盾した結果を生成するケースがいくつか見られます。すなわち、とても異なるシグマ値の収量で複数実行します。しかしながら、よくポリッシングのために使われた実際のシグマ値が光っている粒子を再精密化した後、分解能のマップのためにあまり重要ではないと述べました。それゆえに、トレーニングは計算的に高いのでデフォルトのパラメータで直接ポリッシングを実行した方がいいでしょう。(σvel=0.2;σdiv=5000;σacc=2)すなわち特定のデータセットでは、トレーニングなしがいいでしょう。

9 Locak-resolution estimation(ローカル解像度推定)

後処理プログラム[Post-processing]から推定される分解能は広域的な推定となります。しかしながら、たった1つの数では高分子複合体の再構築でしばしば観測される分解能が場所ごとで異なることを描写できません。Alp Kucukelbir and Hemant Tagare はマップ全体の解像度の変化を推定する効果的なプログラムを記述しています。[7] RELIONは[Local resolution]job-type を通してプログラムのラッパーを実装しています。代わりに全体のマップ周りを動く柔らかい球状のマスクでpost-processingのような手順を実行するために選ぶことができます。以下が例です。

9.1 Running the job(jobの実行)

[I/O]タブ上で以下のように設定してください。

●One of the two unifiltered half-maps:Refine3d/polished/run_half1_class001_unfil.mrc
●User-provided solvent mask:MaskCreate/first3dref/mask.mrc
●Calibrated pixel size: 1.244

(時には、正しいピクセルサイズと思ったモデルを作り始めたときに実際は何%かずれていることを発見します。RELIONの中身はこの点までのすべては、首尾一貫していました。なので、マップの精密化や/とデータの分類化は必要がありませんでした。する必要があるすべては、正しい地図と最終的な解像度推定のためにここに正しいピクセルサイズを提供することです。) ResMapをセットして、Use ResMap?をNoとしてRelionタブをセットして以下のように設定してください。

●Use Relion? Yes
●User-provided B-factor:-30

(この値は、ローカリーフィルターとマップを鋭くする計算をすることも慣れています。おそらく、Post-processing jobの間で機械的に測定した値に近い値を使いたいでしょう。)

●MTF of the detector (STAR file):mtf_k2_300kV.star

(Post-processing jobと同じです。)

9.2 Analysing the results(結果の分析)

エイリアスとしてポリッシュを使いました。8MPIprocessで実行したときこのjobは7分かかります。出力はLocalRes/polished/relion_locres.mrcと呼ばれます。ローカル解像度によりPostprocess/polished/postprocess.mrcマップに色を付けるUCSFChimeraで使われたかもしれないファイルです。Tools->Volume data->Surface colorを使ってby volume data valueを選んでresmapファイルを拾い読みます。特有のRELIONのオプションは1つのマップの質における全体の差異をするlocally-filteredとsharpend mapの出力を追加します。このマップは、local/Res/polished/relion_locres_filtered.mrcに保存されUCSFChimeraで直接ビジュアライズすることができます。(オプションで前のローカル解像度によって色を付けます。)

10 Checking the handedness(利き手のチェック)

マップの慎重な検査は利き手が間違ったことを指し示します。例えば、α-ヘリックスは間違った方法の向きを変えるからです。顕微鏡使用ステージのチルティングなしでデータセットから絶対的な利き手を決心するのは不可能であることを覚えておいてください。したがって、3D initial model job-typeのSGPアルゴリズムは、逆の手である50%の可能性があります。あらかじめ計算された結果では、これは本当に本当です。ある方法で以下の通りに後処理されたマップの利き手を動かしてください。 relion_image_handler --i PostProcess/polished/postprocess.mrc --o PostProcess/polished/postprocess_invert.mrc --invert_hand 同じコマンドもまた他のどのマップで実行することができます。手が間違っていると画像処理手順の前に気が付いたら他の手に変更してください。RELIONは自身で両手が区別されない問題を解決することができませんが、気が付くとすぐに手を動かすことはより便利である場合があります。一度正しい手にするとマップでUCSFChimeraに読み込みβ-ガラクトシダーゼの原子モデルで上書きしたいとします。PDBID 5a1aを用いたPDBから直鎖上の原子モデルをフェッチすることができたはずです。

11 まとめ

11.1 フローチャートの作成

どのようにして最終的な再構築をするか気になるでしょう。Finished jobリストから実行した最後の動作を選択し、Job actionsボタンからMake flowchartオプションを試してください。これを実行するためにはシステムにLATEXTikZパッケージが必要となります。最初の項は正確な作業名のないフローチャートの全体像です。これは、出版目的に役立つでしょう(おそらくお気に入りのvector-based designプログラムの編集後に)。フローチャートの全体像の後に、最初の詳細なフローチャートにどのようにして終了するかが示されています。10ステップ以上からなるフローチャートは複数の構成要素に分けられることに注意してください。作業中に複数枝分かれすることがあるでしょう。それ故に、最終作業のフローチャートに従って、それぞれの分岐についてフローチャートがあるでしょう。リンクをクリックすることでPDFファイルから合致する位置を得ることができます。

11.2 ディレクトリのクリーンアップ

ディスクの空間を確保するために、RELIONは作業ディレクトリをクリーンアップするオプションを持っています。これには2つのモードがあります。gentleクリーンは作業ディレクトリから中間ファイルのみを削除します。harshクリーンは作業からのインプットを必要とする新たな作業を開始するのに必要なファイルを削除します。例えば、harshクリーンはMotion Corr作業から平均化された、あるいはParticle extraction作業から少量のスタックを抽出された顕微鏡写真を削除します。一方、gentleクリーンは2D classification, 3D classificationあるいは3D auto-refine作業の中間反復からすべてのファイルを削除します。Job actionsボタンから個別に作業をクリーンアップすることができます。あるいは、GUIのトップメニューから下がった、Jobsからすべての作業をクリーンアップすることができます。私たちは計算前の結果に頭を悩ませていたプロジェクトディレクトリのtarballを作る前にそのメニューからGently clean all jobsオプションを使いました。長期間保存されていたデータを取る前にプロジェクトディレクトリをクリーンアップしたいでしょう。

11.3 質問や引用

以上です!このチュートリアルを楽しんで、そして役に立つことを願います。もしRELIONについて質問があれば、初めにRELION WikiFAQCCPEMメーリングリストを確認してください。それが助けにならなければ、CCPEMリストを利用して質問してください。お願いですから、決してSjorsに直接メールを送信しないでください。質問全てに返答できるわけではありません。もしRELIONが利用者の研究に有益であると思ったら私たちの論文を引用し、あなたの研究仲間たちに伝えてください。

11.4 参考文献

RELIONの手順の改善を支持した理論の詳細は以下の論文で述べられています。

  • S.H.W. Scheres (2012) “RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination” J. Struc. Biol., 180, 519-530.
  • S.H.W. Scheres (2012) “A Bayesian view on cryo-EM structure determination” J. Mol. Biol., 415, 406-418.

RELIONの使い方に関する包括的な概観は以下の論文に述べられています。

  • S.H.W. Scheres (2016) “Processing of structurally heterogeneous cryo-EM data in RELION” Meth. Enzym., 579, 125-157.


12 付録 A:インストールの注意

12.1 MPIのインストール

MPI(message passing interface)がインストールされた計算機クラスター、もしくはNVIDIA GPU搭載のマルチコアデスクトップマシンが必要になることに注意してください。RELIONをコンパイルするには、mpi-develパッケージが必要です。おそらく存在する種類(MPICH, LAM-MPI, etc)またはバージョンはそれほど重要ではありません。まだシステム内にmpi-develをインストールしてなければ、openMPIをインストールすることをお勧めします。

12.2 CUDAのインストール

NVIDIAの比較的新しいGPU(compute capability 3.5+以上)を持っている場合、オートピッキング、分類、精密化作業を高速に実行できます。GPU-accelerationサポートを含むRELIONをコンパイルするには、CUDAをインストールする必要があります。このチュートリアルの準備にはCUDA-8.0を使用しました。NVIDIAのWebサイトからダウンロードしてください。

12.3 RELIONのインストール

RELIONはオープンソースのソフトウェアです。the RELION wikiから無料でダウンロードして、手順に従ってインストールしてください。もし、job submission system(Sun Grid EngineやPBS/TORQUE etc)に詳しくない場合は、インストール手順の説明にあるように、qsub.cshスクリプトの設定に関して、システム管理者にお尋ねください。分散メモリ並列化のためのMPIと、共用メモリの並列化のためのpthreadsの両方を使用する、いわゆるハイブリッド並列計算を実行したいときは注意してください。ジョブキューイングシステムはこれを可能とするためにいくつかの調整が必要な場合があります。再度、システム管理者にお尋ねください。

12.4 モーション補正ソフトウェアのインストール

RELION-3.0は全フレーム顕微鏡写真ムービーアライメントに使用される、UCSFプログラムMOTIONCOR2へのラッパーを提供します。Dabid Agardのページからプログラムをダウンロードし、インストールの手順に従ってください。また、RELIONの保有する、MOTIONCOR2の実行を使うかもしれません。なので、もし、UCSF実行をインストールするのに問題が発生しても心配しないでください。バージョン3.0において、Nico grigorieff’s groupからUNBLURへのラッパーはGUIから中止されていることに注意してください。

12.5 CTF推定ソフトウェアのインストール

CTF推定はRELIONに含まれていません。代わりに、RELIONはAlexis RohouやNiko Grigorieff’s CTFFIND4へのラッパーを提供します。Niko’s CTFFIND websiteからダウンロードし、手順に従ってインストールしてください。また、もし、パソコンにNVIDIA graphics card(GPU)が入っているならKai Zhang’s GCTFを使うこともできます。その際は、LMBに関するKaiのWebサイトからダウンロードしてください。

12.6 RESMAPのインストール

局所分解能推定はRELIONが所有するポストプロセッシングプログラムの中、あるいはAlp KucukelbirのRESMAPへのラッパーを通して実行される。AlpのRESMAP Webサイトからダウンロードし、手順に従ってインストールしてください。



13 付録B:RELIONの利用

13.1 GUIについて

13.1.1 pipeline approach

RELION-3.0では、一つのプログラムの出力を次のプログラムの入力として順次繋いでいくような情報の受け渡し(パイプライン)を円滑に実現できるようなGUIを設計しました。詳細は2016 Proceedings of the CCP-EM Spring Symposium[3]で公開されています。  RELION-3.0を使うにあたって、まずプロジェクト(すなわち構造決定したい分子)ごとにディレクトリを作成することを推奨します。ここではこのディレクトリの呼称をプロジェクトディレクトリとします。RELIONのGUIは「relion」とコマンドを打つことで起動させることができますが、この動作は常にプロジェクトディレクトリに移動してから行うことを念頭に置いてください。

このソフトのGUIでは、すべてのジョブや、あるジョブによる出力がどのように他のジョブの入力に使われたのかといった履歴を保存することができ、この機能によってパイプラインが形成されます。各種ジョブにはそれぞれ独自の出力ディレクトリが与えられます。ここではたとえば あるジョブの出力のためにClass2D/ というディレクトリができるとします。こういったジョブディレクトリの中でさらに新しいジョブが実行されると、その新しいジョブには一連の番号が与えられます。たとえばClass2Dのもとで作られたとあるジョブにはClass2D/job010という番号が振り分けられます。さらに、ジョブディレクトリのもとでは、Class2D/job010/run といったように出力名が定められます。このソフトでは、各ジョブに意味のある名前が付けられるような仕組みを備えるために、ファイルシステム上の個々のジョブディレクトリへの記号リンクとして実装された"エイリアス"システムを使用しています。 パイプラインに関するすべての情報はdefault_pipeline.starという名前のファイルに保存されていますが、基本的にはこのファイルを見る必要はありません。もしdefault_pipeline.starファイルが壊れてしまった場合は、最後に実行したジョブディレクトリで保存されたバックアップから復元することができます。

13.1.2 The upper half: jobtype-browser and parameter-panel(上半分:jobタイプブラウザとパラメータパネル)

このソフトのGUIは上半分と下半分に分かれています。上半分の左側にはジョブの種類が縦リスト上に並べられており、行いたいジョブを選ぶことができます。たとえば2D classificationを行いたいときは、上半分の左側のブラウザで選択すればいいわけです。上半分の右側には複数のタブがあるパネルがあり、それぞれのジョブタイプへのパラメータを入力できます。GUIの左上には機能のおおよその概要が分かる3つのメニューが書かれています。 【Schedule】ボタンでは、後でジョブを実行するときのスケジューリングを行うことができます。それに対して【Run now!】ボタンは今すぐに実行したいときに使います。【Schedule】ボタンは、繰り返し実行できるよう完全自動化された「パイプライン」を用意したいときに役立ちます。たとえば、データが収集されていくにつれてそれが瞬時に反映できるようなパイプラインを実現したいときに有効です。詳細は13.3を参照してください。 GUIの左側のjobtype-browserをクリックすると、新しい動作(【Run now!】ボタン付き)が右側のパラメータパネルにロードされます。

13.1.3 The lower half: job-lists and stdout/stderr windows

GUIの下半分には、まだ実行中のジョブ(【Running jobs】)、すでに完了しているジョブ(【Finished jobs】)、または後で実行するようにスケジュールされたジョブ(【Scheduled jobs】)のリストがあります。これらのリスト内のジョブをクリックすると、そのジョブのパラメータがパラメータパネルにロードされ、【Run now!】ボタンの色が変わり、【continue now!】に変わります。それをクリックすると、新しい出力jobディレクトリが作成されることはありませんが、パラメータパネルで指定されたパラメータに従ってjobが続行されます。【2D classification】、【3D classification】、【3D auto-refine】のジョブでは、_optimiser.starというファイルが必要になり、ファイル名には、run_ct23のような継続された繰り返しのファイル名が付きます。他のjobタイプでは、それらが以前に実行されるまで、その時点から継続することができます。【モーション補正】、【CTF推定】、【自動ピッキング】、【粒子抽出】は、これまでに行われていなかった顕微鏡写真でのみ実行されます。【Input to this job】(このjobへの入力)と【Output from this job】(このjobからの出力)は、リンクjobをまとめてリストし、プロジェクト履歴内を前後にブラウズするために使用できます。

GUIの下半分の下部には、選択された(実行済みまたは実行中の)jobの標準出力(stdout)と標準エラー出力(stderr)がそれぞれ黒と赤のテキストで表示されます。標準エラー出力は理想的には何もない状態でなければなりません。これらのテキスト表示は、jobリスト内のjobをクリックするたびに更新されます。stdoutまたはstderrのディスプレイをダブルクリックすると、スクロールがしやすくなるようテキスト全体を含むポップアップウィンドウが開きます。

13.1.4 The Display button(ディスプレイボタン)

runボタンとscheduleボタンの下にある【Display:】ボタンでは、各ジョブにおける最重要たる入力ファイルと出力ファイルを視覚的に表示することができます。GUIの下半分にあるjobリストのうちのひとつのjobを選択した後に【Display:】ボタンをクリックすると、選択されたjobの入力と出力がすべて(例えば、パーティクル、顕微鏡写真、座標、 PDFファイルなど)がポップアップメニューとして表示されます。中間体のファイルを表示するといったような一般的な機能はGUI左上の3つのメニューのうちFile>Displayを選択することで使うことができます。

2.1.5 The Job action button(jobアクションボタン)

【Job action】ボタンは、選択した(実行中、完了後、またはスケジュールされた)ジョブの設定を含む小さなメニューを開きます。ここで、note.txtというファイルにアクセスすることができます。このファイルは個々のジョブディレクトリに保存されており、ユーザーのコメントを格納したり、jobのエイリアスを変更したり、jobを終えたものをマークすることができたり、job履歴のフローチャートを作ったり(LATEXとTikZパッケージがシステムにインストールされている場合は、第11章を参照してください)、ディスク容量を節約するためにjobを削除またはクリーンアップ(13.1.6参照)したりすることができます。

2.1.6 Clean-up to save disk space(ディスク領域を節約するためのクリーンアップ)

ジョブを削除すると、ジョブディレクトリ全体がプロジェクトディレクトリからTrash/というディレクトリに移動します。RELIONの左上にある【File】メニューの【Trash】フォルダを空にすると、完全に削除され空き領域が増えます。これを行うまでは、左上の[job]メニューから対応する設定を使用して、ジョブを復元することができます。

ディスク容量を節約するため、ジョブを「clean」にすると、refine jobのすべての中間的な繰り返しに対して書き出されたファイルのような中間ファイルをごみ箱フォルダに移動します。これには2つのクリーニングオプションがあり、片方は【gentle clean】という方法です。この方法では、他のジョブへの入力として使用できるすべてのファイルをそのまま残します。もう一方は【harsh clean】という完全なクリーニング方法です。この方法では全てのファイルを消すことになるため、より多くの容量を確保できます。その中でも【Motion correction】、【Particle extraction】、【Movie refinement】、【Particle polishing】のジョブタイプから選択できる粒子スタック、または顕微鏡写真を含むディレクトリに関しては、とりわけ多くの容量を確保できます。

 また、RELIONの左上にある【job】メニューの対応するオプション(【Gently clean all jobs】あるいは、【Harshly clean all jobs】)を使用して、プロジェクト内のすべてのディレクトリをワンクリックで消去することもできます。 その際、特定のディレクトリを削除対象から除外したい場合には、NO_HARSH_CLEANというファイルをその中に置いてください。

 例えば、保護したい粒子データがjob098にある場合、次のコマンドを実行してください。

 $ touch Polish/job098/NO_HARSH_CLEAN

※ touchコマンドは、指定したファイルが存在しない場合には空のファイルを作成するプログラムです。存在している場合には、ファイルの修正時刻を変更します。


13.2 それぞれの環境におけるけさんを最適化

13.2.1 GPU-acceleration(GPUによる高速化)

Erik Lindahl(ストックホルム)のグループのDari KimaniusとBjoern Forsbergは、RELIONの計算コストの高い部分を移植して、GPUを使うようになりました。彼らはこの作業を行うためにNVIDIAのCUDA-librariesを使用したため、RELION内のGPUアクセレータはNVIDIAカードでしか動作しません。NAVIDIAのGPUはcompute campacity 3.5以上である必要があります。単精度と倍精度の両方のカードが動作するため、高価な倍精度カードに限らず安価なゲーミングカードを使用することもできます。2つの異なるRELIONプログラムがGPUにより高速化されています。それは、relion_autopick(自動ピッキング)とrelion_refine(2次元分類、3次元分類、3次元自動精密化job)です。これらのプログラムのシーケンシャル版とMPI版の両方が加速されました。

13.2.2 Disk access(ディスクへのアクセス)

GPUアクセレータによって画像処理速度があるかに向上したため、ハードディスクへのアクセスがますます妨げられるようになりました。RELION-2.0のGUIには、データセットとコンピュータセットアップのディスクアクセスを最適化するためのいくつかのオプションが用意されています。2次元分類、3次元初期モデル、3次元分類、そして3次元自動精密化のためにパラレルディスクI/Oの使用【use parallel disc I/O】を選択できます。Yesに選択したとき、すべてのMPIプロセスがハードディスクから同時に粒子を読み込みます。そうでないときは、マスターだけがイメージを読み取り、ネットワークを通してこれらをスレーブに送信します。fhgfsのglusterのような並列ファイルシステムは、並列ディスクI/Oで優れています。NFSは並行してたくさんのスレーブを読み込むと中断してしまうでしょう。     メモリ中にプールされた粒子の数【number of pooled particles】を設定することもできます。粒子はMPIスレーブによって個々のバッチに加工されます。各々のバッチの間で、粒子画像のスタックは、一度だけ開閉され、ディスクアクセス時間を改善します。1つのバッチのすべての粒子画像は一斉にメモリに読み込まれます。これらのバッチのサイズは、使われるスレッドあたり、少なくとも1つです。このパーラメータは、スレッドごとにバッチ内で一緒に読み込まれる粒子の数を制御します。もし、3にセットし、1つにつき8つのスレッドが使われるとすると、3x8 = 24個の粒子のバッチが一緒に読み込まれます。これによりディスクアクセス、特にメタデータ処理が問題であるディスクアクセスシステムのパフォーマンスが向上するでしょう。それは、控えめなRAM使用を与えます。もし、比較的小さなデータセット(及び/または大量のRNAを持つコンピュータ)を持つとすると、計算のはじめに全ての粒子をRNAに先行読み取りすることができます【pre-reqd all particles into RAM】。これによりディスクアクセスが比較的遅いシステムの計算を大幅に高速化することが出来るでしょう。しかしながら、使用可能なRNAの量には注意が必要です。粒子はフロート精度で読み込まれるため、N粒子をRNAにお読み込むためには(N×boxsize×boxsize×4)/(1024×1024×1024)GBが必要です。200ピクセルのボックスサイズの100,000個の粒子は15GBとなり、または、400ピクセルのボックスサイズで同じ粒子の数では60GBとなる。データセットが大きすぎてRAMに先読みできないが、各計算ノードに同じ名前でマウントされたローカルの高速ディスク(ソリッドステートドライブなど)(スクラッチディスクと呼ぶ)がある場合、各MPIスレーブはすべての粒子を 計算を開始する前にローカルディスクを使用することができます。これは、粒子をスクラッチディレクトリにコピーすることによって行われます【Copy particles to scratch directory.】。もし、多様なスレーブが同じノード上で実行されると、最初のスレーブだけが粒子にコピーされます。もし、全体のデータセットを保持するのにローカルディスクが小さすぎると、これらの粒子はもはやスクラッチディスクに当てはまらないで、元々の位置から読み取られるでしょう。Relion_volatileと呼ばれるAサブディレクトリは指定されたディレクトリ名の内部につくられます。例えば、/ssdを指定すると、/ssd/relion_volatileという名のディレクトリが作成されます。もし、/ssd/relion_volatileという名のディレクトリが既に存在してたとすると、粒子をコピーする前に消去されます。その後、プログラムはすべての入力粒子を、このディレクトリ内の単一な大きさのスタックにコピーします。もしこのjobが正確に終了すると、/ssd/relion_volatileのディレクトリは再び消去されるでしょう。もし、このjobが終了する前に故障すると、自分で除去したいと思うことでしょう。このプログラムは、すべての人が書き込むことの許可を持って/ssd/relion_volatileを作成します。それにより、スクラッチディレクトリとしてユーザーネーム無しで/ssdを使用することを選択することが出来ます。その方が、各計算ノード上の1人のユーザーが常に1つのjobしか実行しないという条件で、ローカルディスクは、jobがクラッシュし、ユーザーがスクラッチディスクのクリーニングを忘れたときでも、ジャンクでいっぱいになる危険性はありません。最後に、ディスクを通して繰り返しを組み合わせるオプション【combine iterations through disc】があります。Yesに設定すると、すべてのMPIスレーブはすべての繰り返しの最後に、蓄積された結果をひとつの大きなファイルに書き出します。MPIマスターはこれらすべてのファイルを読み込み、それらをすべて結合し、結合された状態で、ひとつの新しいファイルに書き出します。すべてのMPIスレーブは、その後、その結合された結果を読み込みます。これにより、ネットワークの負荷が軽減されますが、ディスクI / Oの負荷が増加します。これは、期待値ステップ(E-step)の終わりに達する進捗バー(マウスがチーズに達する)とその後の最大化ステップ(M-Step)の開始にかかる時間に影響します。この時間は、非常に効率的なシステム設定に依存します。このオプションは当初、LMBでの古いクラスタ上でのネットワークカードのバグを回避するために実装されました。 今日では、精密化が高解像度に達すると非常に遅くなる傾向があるので、このオプションは使用しない方が望ましいです。


13.3 Scheduling jobs(jobのスケジュール化)

【Schedule】ボタンから、今後のjobの準備をできます。スケジュール化された動作により期待される出力ファイルは、既に【Browse】ボタンから他のjobへの入力として利用できるため、Scheduled jobsに複数の連続した動作の「パイプライン」を構築することが可能です。GUIの左上にある【Autorun】メニューからスケジュール化されたjobを実行することができます。そのプログラムは何回スケジュール化された動作を実行したいかを訊ねてくるでしょう。1より大きい値を指定すると、すべてのスケジュールしたjobが繰り返し実行されます。この設定にした場合、スケジュール化されたjobが一周毎に、何分経過させるべきかという質問が出てきます。(もしスケジュールしたjobの実行時間がこの時間よりも短い場合、このプログラムは、次にスケジュールしてあるjobの実行を待ちます。)jobタイプが、【Import】、【Motion correction】、【CTF estimation】、【Auto-picking】、【Particle extraction】、【Movie refinment】である場合には、以前の反復で完了していない顕微鏡写真のみを処理します。他のすべてのjobタイプでは、スケジュール化されたjobの各反復後、最初から計算を再スタートするでしょう。

13.4 On-the-fly processing(撮影しながら処理を実行)

これから紹介するRELION-3.0はスケジュール化されたjobをパイプラインに追加することと、これらをコマンドラインから実行うることを可能にします。これによって進化を可能にされたRelion_it.pyと呼ばれるスクリプトは、RELIONに組み込まれた/scriptsのディレクトリの中で見つけることが出来ます。このスクリプトは次の手順で自動的に実行される。   ●*.mrcsか*.mrcか*/tiffのすべてのファイルの入力は、動画と平均化された顕微鏡写真(*.mrcのみ)のどちらにもなり得ることができます。大きなファイルをコピーするのにはたくさんの時間がかかり、まだコピーが終わっていない動画や顕微鏡写真を入力するのは好ましくないため、このスクリプトはファイルを一時的なファイル名でコピーし、コピーが完全に終了したときにのみ、ファイルを適切なファイル名に変更するべきでしょう。   ●入力されたファイルが動画の場合:Motion correction

  ● CTF estimation
  ● Auto-pickingはRELION-3.0の新しい特徴である:reference-freeからピックされLaplacian-of Gaussian(LoG)フィルターに基づいています

 ●Particle extraction

 この手順はたくさん繰り返され、そして、各反復の間に追加された新しい画像だけが加工されるでしょう。一方では、スクリプトがいくつの分子が引き抜かれたかを同様に観察しています。ユーザー指定の数の粒子が抽出されると、スクリプトは、ユーザー指定の数の粒子のバッチで、2D分類/3D分類jobも起動します。3D参照がまだ利用できない場合、スクリプトは3D初期モデルjobを使用して自動的に生成することもできます。必要に応じて、スクリプトはすべての顕微鏡写真をもう一度通過します。そのため、最初の分子から適切な3D参照が取得されているので、これを使用してテンプレートベースの自動ピッキングjobの投影を生成します。おそらく最初のパスで使用されたものより大きいBoxのサイズを有するピッキングランから抽出された粒子は、その後2D分類/3D分類jobに再度使用することができます。セットアップ全体では、収集中の画像をその場で簡単に処理することができます。また、プロジェクトディレクトリでGUIを開くことにより、プロセスを追跡することができます。顕微鏡でのデータ収集中にすでに2次元クラスの平均を調べることは、データを最初に取得する価値があるかどうか、または、方位分布が可能か、または、氷の厚い領域で収集する必要があるかどうかを判断するために役立ちます。オンザフライ3D再構成は、例えば、ある補因子が関心のある複合体に結合しているかどうかを確認するために有用であり得る。パイソンで書かれているので、スクリプトを修正するのは比較的簡単です。そして、私たちはこのスクリプトが多くのユーザーのニーズと設定を反映するために多くの異なる方法で修正されるかもしれないと思われます。例えば、取得されているデータセットの達成可能な解像度を評価するために3D自動更新jobを非常に簡単に追加できます。


13.5 Heerical reconstruction(ヘリカル再建)

Scheresグループの博士課程学生であるShaoda Heは、ヘリカルアセンブリ処理のためのワークフローを実装しています。これには、【Auto-picking】、【Partcle extraction】、【2Dclassification】、【3Dclassification】、【3D auto-refine】、【Particle polishing】、および【Mask create】といったjobタイプのパラメータパネルへの追加タブが含まれます。ヘリ    カル再建を処理するための個別のチュートリアルはありません。一般的な原則は、このチュートリアルで取り上げている単粒子分析と同じです。したがって、ヘリカル処理にRELIONを使用するつもりのユーザーは、このチュートリアルを最初に実行することをお勧めします。これらオプションのより詳細な説明は、ユーザーがRELION Wikiの関連するページ、またはShaodaの論文から参照できます。

13.6 Sub-tomogram averaging(サブ断層写真の平均化)

MRC-LMBのLoweグループの元博士号であるtanmay Bharatの助けを借りて実装されたサブ断層撮影の平均化。一般的な概念の多くは単一粒子解析と同じであり、RELIONで顕微鏡画像の平均化を実行するユーザーは、このチュートリアルを先に進めることをお勧めします。サブ断層画像平均化の手順の詳細な説明については、ユーザーはRELION wikiの対応するページ、またはTanmayの論文を参照してください。なお、サブ断層像平均化パイプラインをより使いやすく、よりよくするための努力を続けています。この作業は、MRC-LMBでも、John Briggsのグループと密接に協力して行われています。一方、サブ断層像平均化パイプラインは単一粒子のものよりもかなり合理化されておらず、多くの場合、RELIONパイプラインの外側でスクリプトを作成する準備をする必要があります。

13.7 Interaction with other programs(他のプログラムとの相互)

原則として、RELIONは異なるプログラムによって抽出されたパーティクルを使用できますが、これは推奨される手順ではありません。多くのプログラムは粒子自身を変更します。位相反転、バンドパスまたはウィーナーフィルタリング、マスキングなどを介して行われます。これらはすべて、その後のRELIONでの使用には最適とは言えません。さらに、必要なメタデータすべてを正しくフォーマットされたRELIONタイプのSTARファイルにまとめると、エラーが発生する可能性があります。 RELIONでパーティクルを再抽出するのは簡単で非常に高速であるため、以下に概説する手順は多くの場合RELIONへのはるかに簡単な(そしてより良い)経路です。また、RELIONを囲むラッパーの実装もいくつか報告されました(例えばEMAN2、SCIPION、APPIONなど)。他の人がこれらのラッパーを書くとき私たちは役に立つように努めますが、私たちはそれらを完全に制御することができず、彼らの最終製品が最良の方法でRELIONを使うかどうか知りません。したがって、これらのラッパーで得られた結果に疑問がある場合は、このチュートリアルで概説している手順に従うことをお勧めします。