eTomoチュートリアル

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eTomoチュートリアル


未加工のチルトシリーズの初期設定と表示

 このチュートリアルでは、小さな2軸のサンプルデータセットと、Etomoへのステップバイステップガイドが含まれています。 このチュートリアルは、トモグラフィガイドを置き換えるものではありません。各ステップの詳細については、より包括的なトモグラフィガイドを参照してください。サンプルデータセットは、プロセス全体を問題なく処理する必要があるため選択されました。トモグラフィガイドは、2軸断層撮影の計算に使用される多くのプログラムのトラブルシューティングと学習に関する参考資料です。

 このチュートリアルのこのバージョンでは、IMOD 4.9にいくつかの新機能が示されています。 IMOD 4.9がインストールされていない場合は、アップグレードするか、端末にimodhelpと入力し、インストールされているバージョンに含まれるEtomoチュートリアルを選択してください。

 まず、Webサイトからサンプルデータセットをダウンロードしてください。次のように入力してデータを解凍します。

imoduntar tutorialData.tar.gz

 これはチュートリアルを開始するのに必要な2つの未加工のスタックBBa.stとBBb.stをそれぞれ含むディレクトリtutorialDataを作成します。また、データセットの完成後に残っている小さな作業ファイルのすべてを含むサブディレクトリ、finalFiles、および最終的な再構成のコピーがあります。

 ファイル名には、独自のデータセットに従わなければならない規則が反映されています。生スタックには拡張子.stがあり、二重軸スタックには共通のルート名がa.stとb.stで終わります。この拡張子は、単に規約に過ぎず、画像ファイルの形式を示すものではありません。 拡張子.mrcを持つことも可能です。Etomoはファイル名を拡張子.stに変更します。 適切な形式でデータファイルを持っていて他の拡張子を持っている場合は、ファイル名の拡張子を.stに変更する必要があります。

Etomoのセットアップ

Etomoを起動するには、次のように入力します。

etomo

 





 Etomoを最初に起動すると、Front Pageパネルが表示され(上の図を参照)、Etomoで実行する操作を選択できます。この時点で、Build Tomogramボタンを押すか、FileとRecent Projectsメニューの既存のデータセットを開くことで、新しいデータセットの作業を開始できます。


 Build Tomogramを押して、Setup Tomogramパネルを表示します(上の図を参照)。 Project Logウィンドウも開き、アクションの履歴が含まれ、特定の手順に固有の有用なログファイルソリューションがレポートされます。

 新しいデータセットの作業を開始するには、以下のフィールドを入力する必要があります。 Dataset nameは、未加工のチルトシリーズ(または二軸データセットが収集された場合はroot_namea.st)を含むファイルの名前です。Dataset nameフィールドに関連付けられている黄色いファイル選択ボタンをクリックするか、ディレクトリパスとファイル名をフィールドに直接入力して、Detaset nameを入力できます。 Backup directoryは、手順を実行するたびに小さい作業ファイルを保存するオプションのフィールドです。バックアップディレクトリを使用しない場合は、このフィールドを空白のままにできます。

 Templatesボックスで、plasticSection.adocSystem templateを選択します。 このテンプレートはIMODインストールの一部であり、この種の再構成に適したいくつかのパラメータを設定するために使用できます。

 データセットがSingle axis(単軸)かDual axis(二軸)かを選択します。 Montageオプションは、モンタージュチルトシリーズの処理に使用できます。


 次のフィールドは、ピクセルサイズ(nm)、金基準直径(nm)のサイズ、イメージ回転(度)を指定します。 ピクセルサイズ(nm単位)は、顕微鏡、カメラ、および倍率によって異なります。画像回転(垂直からの傾斜軸角度、度)も顕微鏡と倍率によって異なります。 Scan Headerボタンを押すと、MRCファイルヘッダーで指定されている場合はピクセルサイズと画像回転値が取得されます。このチュートリアルの例では、このデータセット(2.02)と画像回転(-12.5)のピクセルサイズを定義するには、Scan Headerを押します。金の基準直径(10 nm)のサイズを指定する必要があります。

 Parallel Processingチェックボックスが有効になっている場合は、チェックを外して画面がここに示されているように見えるようにします。このチュートリアルでは扱いませんが、パラレル処理では、複数のコンピュータまたは1台のコンピュータ上の複数のプロセッサにプロセスを分散させることができます(有効化の方法については、Etomoの使用を参照してください)。Image distortionフィールドのファイルエントリを空白のままにします。 この機能を使用して、非線形の画像歪みが測定され、特性化されていれば補正することができます。これはエネルギーフィルタのデータで特に有効です。Mag勾配補正項目を空白のままにします。この機能には、各画像に適用される倍率勾配を持つファイルが含まれています。これは、モンタージュデータでの使用に便利です。

 Axis Aおよび必要に応じてAxis Bボックスのいずれか一方または両方の軸の傾き角度のソースを指定します。この例では、傾斜角が拡張ヘッダに格納されるため、データからのデフォルトの抽出傾斜角を使用する必要があります。ゼロ度から2方向に撮影したチルトシリーズを再構成する場合は、Series was bidirectional fromをオンにすることができます。これにより、適切なアライメントパラメータの設定が行われます。必要に応じて、個々の投影を指定して、処理ステップから除外することもできます。この除外リストの構文は、コンマで区切られた範囲のリストです(1,4-5,60-70など)。このセクションには、3dmodで表示するための生データファイルを開くためのボタンもあります。

 前処理ステップの決定や、画質の悪い特定のビューがあるかどうかを確認したり、アライメントと再構成から除外したりする場合は、未加工のチルトシリーズファイルを見ると便利です。

 ビューの画質が悪い(フォーカスがないなど)かどうかを判断するには、Raw Image Stackボタンを押してRawスタックを開きます。 動画を通してマウスの中ボタンをクリックすることで未加工のチルトシリーズの画像を表示します。どのように画像が少し跳ね上がるかに注目してください。アライメントと再構成から除外する特定のビューを書き留めます。このサンプルデータセットでは、除外する必要がある画像はありません。


 チュートリアルのサンプルデータセットに固有の詳細は上に示されています。このサンプルデータセットの場合、Dataset nameはBBa.stです。 それは二重軸セットです。画素サイズは2.02nmであり、基準直径は10nmであり、画像回転は-12.5度である。このデータセットの傾斜角度は、データファイルから保存され、抽出されます。

 Create Com Scriptsボタンを押して断層像の生成に進みます。


Etomoメインウィンドウ

 このチュートリアルを終了する前にEtomoを終了する必要がある場合は、中止したところからデータセットが含まれているチュートリアルデータディレクトリに移動し、次のように入力して続行できます。

 $  etomo BB.edf

 メインウィンドウはいくつかの領域で構成されています。左側には、操作する断層像計算の特定のステージを選択できるボタン(プロセス制御ボタン)の列があります。一番上には、現在のプロセスまたは完了した最後のプロセスのステータスを通知するプロセスモニタがあります。プロセスモニタの左側には、Axis AとAxis Bの間を移動するためのAxisボタンがあります。メインウィンドウは現在、Axis Aに対して開いています。


 プロセス制御ボタンは、上から下に向かって処理の順番に並べられています。ボタンはプロセスの段階を示すために色分けされています。赤はプロセスが開始されていないことを示し、マゼンタはプロセスが現在進行中であることを示し、緑はプロセスが完了したことを示します。いずれかのボタンが選択されると、ウィンドウの右側に特定のプロセスに関連する情報とフィールドが表示されます。これらのフォームはプロセスパネルと呼ばれます。それらを使用すると、必要なパラメータを変更し、その処理ステップで必要な特定のプログラムを実行することができます。各プロセスパネルのパラメータとボタンは通常、フローチャートのように実行する順序で上から下に配置されます。プロセスを実行すると(プロセスパネルのいずれかのボタンを押すと)、プロセスモニターはプロセスの処理が完了したこととその時間を表示します。


前処理

 画像がCCDカメラを使用して顕微鏡上で収集された場合、最初の暗い電子または個々の画像の収集中にCCDカメラに当たるランダムなX線が、データファイルのピクセル値の極端な高低差を引き起こす可能性があります。その結果、これらの極端な値はコントラストを破壊し、再構成に人工的な効果を引き起こす可能性があります。このチュートリアルの例では、このような問題を引き起こす極端なピクセル値はありません。ただし、これらのピクセル値を削除する手順については、ここで概要を説明する。最初に、ファイルに極端なピクセル値があるかどうかを判断する簡単な方法は、未処理のスタックのイメージヘッダーの最小値と最大値を調べることです。これを行うには、コマンドラインターミナルで次のように入力する。

$ header BBa.st

 最小値、最大値、および平均濃度の値に注目します。最小濃度値が負の数または0である場合、暗い電子の収集中にX線イベントが原因で、データセットに極端な黒いピクセルがある可能性があります。最大濃度が高い場合は、データセットに極端な白いピクセルがあります。極端な値がデータセットのどこかに潜んでいて、それらを削除するための前処理が必要な場合は、前処理ボタンを押してこのパネルを開きます。


 前処理に関連する基本的な手順(チュートリアルのデータセットでは不要)を以下に示します。

・Show Min / Max for Raw Stack ボタンを押すと、各セクションの最小密度と最大密度をRawスタックに表示するプログラムであるクリップ統計が実行されます。テキスト出力とこれらの密度のグラフが表示された状態でウィンドウが開きます。

・Create Fixed Stack ボタンを押して、X線を除去した第2のスタックを作成します。

・View Fixed Stack ボタンを押してそのスタックを表示し、Show Min / Max for Raw Stackボタンを押して固定スタックのクリップ統計を実行します。極端なピクセル値が修正されているかどうかを確認します。

・3dmodの黒と白のスライダが非常に接近していない状態でコントラストが良好に表示され、未処理のスタッククリップの統計出力からの異常な値が固定スタック出力からなくなった場合は、Use Fixed Stackボタンを押します。

この操作の詳細については、トモグラフィガイドの PRE-PROCESSING: REMOVING X-RAYSセクションを参照して下さい。


粗調整

“Coarse Alignment”プロセス制御ボタンを押して、粗く整列したスタックを作成します。


“Calculate Cross-Correlation”ボタンを押すと、隣り合う傾斜画像毎の相互相関プログラムが実行されます。

  • このプログラムは、相互相関を用いて、傾き系列の連続する画像間の最初の並進アライメントを見つけまう(すなわち、xとyだけシフトする)。
  • 出力ファイル“BBa.prexf”には、次のステップで画像データに適用される変換(または推奨シフト)のリストが含まれています。


“Generate Coarse Aligned Stack”ボタンを押すと、2つのプログラムが実行されます。 Xftoxgは、傾き相互相関によって作成された変換を使用して、一貫した「グローバル」アライメントセットを取得します。 これらの新しい変換は、Newstackプログラムを使用して画像データに適用されます。 出力ファイル“BBa.preali”が作成されます。 “View Aligned Stack in 3dmod”ボタンを押すと、プリアライメント(一定方向に整列)されたスタックを見ることができます。 相互に作用するMidasプログラムを使用して、大きな画像シフトを手動で編集することができます。これらは、このデータセットの問題ではありません。詳細については、「トモグラフィガイド」の「粗調製」を参照してください。

Midasが実行されている場合には、傾斜軸が垂直になるようにMidasが画像を回転させるため、傾き軸回転登録が使用されます。 “Fiduclalless alignment”チェックボックスは、基準点アライメントなしでトモグラフィを作成するために選択できます。詳細については、「トモグラフィガイド」の「相関アライメントを使用したクイックトモグラムの作成」を参照してください。 事前にスタックされたスタックに問題がなければ、完了ボタンを押して杉のステップに進みます。

金粒子の位置に基づいた基準モデルの作成

基準モデルを生成するに利用できる3つのオプションがある。 最も一般的なのは、Make seed and trackオプションでいくつかの金粒子基準マーカーを追跡することだ。この開始点は手動または自動で選択できる。これらの開始点はある一部分のみから選ばれ、基準点がそこから追跡されるため、粒子モデルと呼ばれる。データセットに金粒子基準マーカーがないか、少なすぎる場合は、Use patch tracking to make fiducial modelオプションを使用できる。Run RAPTOR and fixオプションは、スタンフォードで開発されたプログラムを使用し、傾斜系列(像の一軸トモグラフィー)を通じて金基準マーカーを自動的に探して追跡する。 詳細については、トモグラフィーガイドのFIDUCIAL MODEL GENERATION(基準モデル作成)の項目を参照。まず初めに新しい機能を使用して、金粒子の位置を自動的に選択する。その後バックアップして古典的な方法へ進むが、これはより不明瞭なデータセットを解析する場合の手順を示すことに適している。

Total number(追跡する粒子の総数)に25を入力し、Select beads on two surfacesにチェックを入れる。

Generate Seed Modelボタンを押す。


操作が完了すると、各平面で選択された粒子の数がProject Logウィンドウに表示される。Open Seed Modelボタンを押すと、選択した粒子の基準点が表示される。粒子の基準点を見るには、1度の部分までスクロールしなければならない。緑色の点は底面の粒子を、マゼンタの点は上面の粒子を色づけている。次のステップでは、このモデルを粒子として使用して完全な基準モデルを作成する。



Track Beadsタブを選択する。

Track Seed Modelボタンを押す。



これにより、粒子追跡プログラムが実行され、他のすべての部分で金粒子が見つかる。tracka.comで作成された出力ファイルは、完成した基準モデルのBBa.fidである。このコンピュータ生成モデルは完全ではなく、基準モデル中にずれが生じる可能性がある。欠落した粒子の基準点の合計数がProject logウィンドウに表示される。多数の基準点が欠落している場合は、Track with Fiducial Model as Seedボタンを押す。これにより、金粒子のような基準モデルを追跡するプログラムが再実行される。この場合、基準点は記入されない。

粒子の基準点がまだ欠落している場合、次の手順ではこの基準モデルを編集する反復プロセスが必要となる。特に、ここにあるように基準点の超過がある場合は、すべてのずれを直す必要はないことに注意。しかし、大部分の粒子の基準点が傾斜系列(像の一軸トモグラフィー)の両端まで追跡されていることを確認することが重要である。


Fix Fiducial Modelボタンを押す。


この手順では、3dmod中に内蔵されたスタック(BBa.preali)と基準モデルファイル(BBa.fid)が開く。


粒子修正のダイアログボックスがFill gapsモードで表示される。粒子修正は、基準モデルの編集を容易にする。

Go to Next Gapボタンをクリックする(または、スペースキーをホットキーとして使用する)。 これによって、隣接する区画上に基準点がない点(黄色の円で強調表示されている点)を表示させる。Page Upキー(ポイントの上に上矢印が表示されている場合)またはPage Downキー(ポイントの上に下矢印が表示されている場合)を使用して欠落している粒子のある区画を探し、マウスの中ボタンを使用して 金粒子の中心を基準点に加える。「+」キーで画像の倍率を上げて、区画のコントラストを調整することは、特にトモグラフィーの傾斜が高いときに便利である。


メイン3dmodウィンドウ上に「No Gaps Not Found」というメッセージが表示されるまで、Go to Next Gapを繰り返す。File -> Save model、またはホットキー「s」を押してモデルファイルを保存し、完了ボタンを押して粒子位置の精細な調整へ進む。


連続的な傾斜の整列

Fine Aligment パネルは、さまざまなアライメントパラメータを解決するための3つのタブのセットで構成されています。 一般的な位置合わせは、最初にFine Alignment boxの下部にあるCompute alignmentボタンを押して行います。


このコマンドファイルでは、プログラムTiltalignを実行して、傾斜したビューの変位、回転、傾きおよび倍率の差異を見出します。このプログラムはfiducial modelでの金粒子の位置と最適なフィットを見つけるためのmetric minimization(メートル最小法)が使われています。これは行われたことの概要を示すログファイルを作成します。すべての未知数に対する合計値と残差誤差平均とsdの比率のレポートがプロジェクトログウィンドウに表示されます。ログファイル全体にアクセスするには、プロセスに関連付けられたウィンドウ領域上でマウスカーソルを右クリックします。これにより、3つまたは4つのセクションに分割されたメニューが開きます。最初のセクションでは、現在のプロセスに関連するログファイルを開くことができます。 2番目のセクションでは、アライメントパラメータのグラフを見ることができますが、他のほとんどのパネルには存在しません。 次のセクションでは現在のプロセスに関連するマニュアルページを開き、最後のメニューセクションでは一般的なヘルプガイドを開きます。ログファイルを開くには、[Align axis: a log file(軸を合わせる:ログファイル)]を選択します。 これにより、このログファイルの完全なログと短いセクションが含まれるタブ付きのファイルが開きます。 私の例では、最初のCompute Alignment runは0.236の残差平均を与えました。


この結果は次のステップを説明するのにとても良いので、ここでバックアップを取っていきます。 最初に3dmodを終了し、ターミナルウィンドウに移動してシードモードを削除するか、名前を変更します。 例: mv BBa.seed BBa_auto.seed

次に、Etomoで、左側のSeed ModelタブのFiducial Model Gen.を押し、画面がこのようになるようにMake seed model manualyを作成します。


View Seed Modelボタンを押す。 (このボタンは別のモデルが作られる前にSeed Fiducial Modelと名付けられていました)。これにより、3dmodでBBa.prealiが開き、BBa.seedと名付けられた空のモデルファイルが作成されます。また、Make SeedとAutocenterにチェックの入った Bead Fixerダイアログボックスが表示されます。オフの場合は、Automatic new contourをチェックします。 3dmodではセッションごとにこの設定が記憶されます


3dmodはファイルを中間セクションに開きます(このチュートリアルスタックのセクション31)。キーボードのInsertキーを押すことで中央のセクションに戻ることができます。


Zap(画像)ウィンドウで、金粒子の中央にカーソルを合わせ、マウスの中央ボタンを押して、モデルポイントを20-30の金粒子の中央に配置します。自動で新しい輪郭がチェックされるので、新しい金粒子ごとに新しい輪郭が作成されます。Autocenterがチェックされているので、3dmodはモデルポイントが金粒子の中央に配置されていることを確認する必要があります。したがって、ギャップを埋めるときほど注意を払う必要はありません。例(BBa.seed)では25個の金粒子を選択しました。 モデルには1つのオブジェクト、25の輪郭が含まれ、各輪郭には1つの点があります。 このシードモデルを保存します。

次に、Track Beadsタブをもう一度選択します。今回は結果が非常に良い状態に保たれるように、Sobel filterのRefine centerをオフにします。


Track Seed Modelを押してシードモードを追跡します。これまでのように、Fix Fiducial Modelを押して、ギャップを記入してください。 もう一度ファインアライメントステップに 進みます。

Compute Alignmentを押します。今回は残差がすこし大きくなっています。



より良いアライメントステップの目標は、このチュートリアルデータセットのピクセルサイズを残差誤差平均0.2〜0.5に減らすことです。 より小さなピクセルサイズのデータセットは、より大きな残留誤差を持つことを意味する。 Tiltalignプログラムは、基準モデルに関する有益な情報を提供する2つのモデルファイルも作成します。最初の(BBa.3dmod)は、解決された位置に基づいて基準点の3次元モデルを表示します。2つのサーフェス上に存在する基準点には2つの異なる色が割り当てられます。 一方はピンクの球、もう一方はグリーンの球です。 Fine Alignmentボックスの下部にある3Dモデルの表示ボタンをクリックして、このモデルを調べます。



見える範囲にピンクとグリーンの球がいい具合に分布しているのが見られます。キーパッドの数字の8を押して回転させ、エッジを表示します。このビューでは2つの表面の分かれ目が見られます。アラインメントが歪曲するのでいずれかの特定の領域に基準点群をもつモデルを使用しないでください。3dmodvウィンドウを閉じます。

Tiltalignが生成する第2のモデルは、残差ベクトルモデルです。 Fine Alignmentボックスの下部にあるView Residual Vectorsボタンを押します。これは、事前に整列されたスタックを3dmodで開き、各セクションに残差ベクトルモデルを表示します。


このモデルは、現在のモデル点を緑色の矢印の原点として、残りの位置を矢印の終点として表示します。この変位は非常に小さい(<2ピクセル)ため、この残留変位は実際のモデル点と区別するために10倍に拡大されています。 大きな(> 2k×2k)画像では、残差モデルはしばしば1つの領域に大きな変位を示しますが、他の領域には存在しません。これらの場合、残差モデルは局所的なアラインメントが必要な時に決めるのに役立ちます。この例では、局所的なアラインメントは必要ありません。一般的に、より極端な傾きにおいてより大きな残差を持ちます。次のいくつかのステップで3dmodを開いたままにして、View / Edit Fiducial Modelボタンを押して基準モデルを編集用にリロードします。これにより、大きな残差モデルを修正モードでBead Fixerダイアログボックスが表示され、aligna.logファイルがロードされます。


以下の反復ステップは、大きな残差を有する基準点を固定することを含む。


Bead FixerダイアログボックスのGo to Next Residualをクリックします。

大きい残差を持つモデルポイントには、推奨移動の方向を指す赤い矢印が表示されます。モデルポイントが金に適切に集中していないことが観察できると思われます。Bead FixerダイアログボックスでMove Point by Residualをクリックすると、モデルポイントが推奨量だけ移動します。これはほとんどの場合良い働きをするのですが、この推奨が間違っていると思われる場合は、カーソルを金粒子の中央に合わせてマウスの右ボタンをクリックすることで手動で移動できます。この推奨は、すべての基準点にフィットする数学的アライメントモデルによって予測された位置であり、粒子が実際に画像内に位置する場所の分析に基づいている訳ではありません。アライメントモデルにうまく収まらないほど歪んだ標本である場合、矢印は実際の金の位置から離れていることがよくあります。




残差が見つからなくなるまでGo to Next 1big 1residualおよびMove Point by Residualを繰り返します。ホットキー(残差によってポイントを移動する)は次の残差に移動します。目標は、それが関連する基準点の上に各点を集中させることです。残りの矢印は必ずしも正しいとは限りません。ポイントはマウスの右ボタンでクリックして移動することもできます。時には、他の表面からの基準点は、現在の基準点の範囲を観察するのを困難にします。ページアップボタンとページダウンボタンを使用して基準点を区別します(ただし、Go to Next Big Residualで選択したセクションに常に戻ります)。Undo Moveボタンを押すと、残差による移動を元に戻すことができます。

修正する残差がなくなると、モデルファイルを保存してファイルを開いたままにします。 aligna.logファイルにアクセスし、Surface Anglesタブに移動します。

下部のTotal tilt angle changeに気を付けてください(この例ではこの値は-0.40でした)。この値をTotal tilt angle offsetの下のFine Alignment Volume Position Parameters boxに入力します。Compute Alignmentボタンをもう一度押します。アラインメントは訂正が組み込まれた状態で計算され、3dmodは結果のログファイルを再度読み込みます。メインの3dmodウィンドウの下部にあるテキストボックスを参照してください。


大きな残差のあるモデル点を修正するには、もう一度進んでください。 モデルを保存します。 データセットの両面に金の分布が良好であれば、歪みを解くことができます。Fine AlignmentボックスのGlobal Variablesタブを押します。


パネルの下部にあるDistortion Solution Type領域でFull solutionオプションを選択します。これにより、X軸方向の伸びと歪みの2種類のねじれが解決されます。既定のグループサイズを維持し、Compute Alignmentボタンを押して配列を実行します。Compute Alignmentが実行されると、3dmodはログファイルを再読み込みします。 3dmodのウィンドウに戻り、歪みを解決した後にTiltalignが示してきた新しい残差の修正を繰り返してください。次に、Bead FixerウィンドウのSave&Run Tiltalignボタンを押してモデルを保存し、位置合わせを計算します。Etomoのパラメータを変更していない限り、このボタンを使用することによりEtomoに戻る必要がなくなります。3dmodでアライメントとチェックのモデルポイントを数回実行した後、最終平均残差は0.2〜0.4になるはずです。 この例では、最後の残留誤差平均は0.326でした。




3つの小さな再構成を作成するためにデータセットをサンプリングする

次のステップンも目標は、できるだけ平坦で最小のボリュームに収まるように再構成をシフトして回転させることです。 これは、断層画像の3つの領域、すなわち、傾斜画像の上部、中央および下部付近から計算された3つの領域をサンプリングすることによって行われる。 (これらのサンプルが適切でない場合は、断層撮影された断層像全体を使ってこれを行うことができます;詳細については、断層撮影ガイドのトモグラム全体の位置づけを参照してください。) 調整可能な2つの回転があります:傾斜軸周りの回転、(断層像の長さ全体にわたって同じ高さZで断面が出るように、X軸周りの回転を含む)X-Z平面で見たときの断面レベルを作るための回転。 IMOD4.9の新機能により、セクションの上面と下面が自動的に検出され、図面を保存して面を定義することができます。 この軸を手動で操作します。2番目の軸に自動位置決め機能を使用します。 これはビニングされたデータセットなので、“Positioning tomogram thickness”を200に減らします。 これにより、元のセクションよりもはるかに厚い再構成が作成されます。 “Create Sample Tomograms”を押します。


このコマンドファイルは、まずイメージスタックの上、中央、下から60ピクセルのスライバ(鋭角や微細な形状のこと)を抽出して整列させます。 次に、これらのサンプルを使用して、整列したスタックの上、中央、下から20個の薄切りの再構成を作成します。 これらの出力ファイルの名前はtopa.rec、mida.rec、bota.recです。“Create Boundary Models”を押します。 このステップでは、各再構成の上面と下面を定義するモデルを作成します。 “Create Boundary Models”を押すと、3次元MODは3つの再構成を一度に読み込み、topa.recが最初に表示され、エッジが表示されます。 3次元MODは、tomopitcha.modという名前の空のモデルからも開始されます。



Zapウィンドウの上部バーには、‘4D’の機能と、前後矢印があります。 前方矢印をクリックすると、それぞれmida.recとbota.recの再構成が繰り返されます。 topa.recから開始する。コントラストスライダを使用してコントラストを調整します。 ボリュームの中央のマテリアルが不鮮明な外観になっていることに注意してください。 これは、生物学的材料を用いた再構築の一部である。 マウスの中央のボタンを使用して、生物材料を含む領域を定義する上面の左側に1つのモデル点を配置し、上面の右側に第2のモデル点を配置します。 線が2つの点を接続します。 セクションの底面を、それぞれ左右2つの点でモデル化します。 Zapウィンドウの上部にある‘4th D’の右にある矢印ボタンを押すことによって、mid.recとbot.recファイルに切り替えます。 他の2つの再構成の上面と底面のモデリングを繰り返します。 最終的なモデルは1つのオブジェクトと6つの輪郭を持ち、各輪郭は2つのモデル点を持つ必要があります。このモデルファイルを保存します。 一般に、最終断層像の厚さは、描く線の間の実際の距離よりも約10-20ピクセルほど厚いことが有効です。 これを達成するために、追加されたボーダーの厚さで入力を調整することができます。 デフォルト値の5は断層像を10ピクセル厚くします。それを10ピクセルに変更して20ピクセル厚にします。 “Compute Z Shift and Pitch Angles”を押します。 これらのモデル輪郭に基づいて、トモピッチは再構成を可能な限りフラットにし、可能な限り最小の容積に収めるためのパラメータを決定する。 これらのオフセットは、既存の角度オフセット、ZシフトおよびX軸傾斜値に自動的に追加されます。

最終断層像の厚さは、トモピッチログからEtomoによって入力されます。





フルサイズのスライス像を作成する最後の実行

Create Final Alignmentボタンを押します。 最終的な配置変換が作成されたら、完了ボタンを押して次のステップに進みます。


最終整列スタックの作成

Create Aligned Stackを押します。 このコマンドは、最終整列されたスタックのフルサイズの画像に整列変換を適用します。 出力ファイルの名前はBBa.aliです。


完全に整列されたスタックは、View Full Aligned Stackを押すことで表示できますが、これは必須ではありません。 CTF補正、基準点の消去、および整列されたスタックのフィルタリングのためのオプションの手順がありますが、ここでも必要ありません。 Done(完了ボタン)を押して次のステップに進みます。

傾斜パラメータセクションの初期設定のフィルタリングパラメータは、多くの場合に適用できますが、変更することもできます。または、整列されたスタックをフィルタリングして再構成時のノイズを減らすことができます(詳細については、トモグラフィガイドのTOMOGRAM GENERATIONセクションを参照してください)。


トモグラムの生成

Generate Tomogramを押します。

断層像が計算されると、View Tomogram in 3dmodを押すことで断層像を調べることができます。 スペースを節約するために、この時点で中間イメージスタックを削除すること(Delete Intermediate Image Stacks)もできます。

マウスの中ボタンを押して、スライス撮影の上面から底面まで一連の断層撮影写真をステップスルーすることによって、再構成を経て映像を再生します。






.第2の軸(軸B)上

軸Bを表示するには、Etomoウィンドウの上部にあるAxis Bボタンを押します。 これにより、軸Bの傾斜シリーズを整列させ、スライス像を計算するための操作を実行するために使用できるもう1組のプロセスボタンが表示されます。 混乱を避けるために、軸Aは青い背景を持ち、軸Bは緑色の背景になっています。

Etomoのメインウィンドウの右側には、軸Bの傾斜シリーズを整列させ、断層像を計算するための操作を実行するためのプロセスボタンがあります。 このサンプルのデータセットでは、前処理ステップは必要ありません。軸Aで説明したように、Coarse Alignmentの過程に進みます。



粗く整列されたスタックが生成されたら、Doneを押して次のステップに進みます。 両方の傾斜軸を組み合わせるには、追跡しているビーズの少なくともいくつか(8-10)が2つのセットで同じでなければなりません。 これを達成するには、基準点の移動プログラムを使用します。


A軸からの基準点の移動


Transfer Fiducials From Other Axisボタンを押すと、最初の軸からの基準モデルに基づいて2番目の軸の粒子基準モデルを作成する基準点の移動プログラム(Transferfid)が実行されます。 プログラムは、最もよく対応する2つのセット中の画像のペアを検索し、最初のセットの基準点を転送して、2番目のセットの粒子基準モデルを作成します。 最後に、プログラムは第1軸と第2軸の間で対応している基準点をリストし、これをProject logウィンドウに表示します。

いくつかの基準点が転送できなかった場合でも心配しないでください。 この例では、19個の基準点が対応しています。


これは少し低く、2つの軸が非常によく一致しないために起こっています。 手動でポイントを追加することもできますが、自動的にポイントを追加すると便利です。Add points to seed model automatically(シードモデルに自動的にポイントを追加)を選択すると、自動粒子パネルが開きます。


Add beads to existing model(既存のモデルにビーズを追加する)が選択されており、2つの断層上の総数(Total number)と選択ビーズの設定も、もう一方の軸から転送されていることに注意してください。


Add Points to Seed Modelを押して、BBb.seedというTransferfidによって生成された粒子基準モデルにさらに多くの基準点を追加します。Track Beads タブを選択し、軸BウィンドウのTrack Seed Model (基準モデル)の追跡に進みます。



これは自動的に軸Bセットの基準点を追跡します。 BBb.fidファイルでの基準点の欠落を修正するには、A軸について上で説明したように、Fix Fiducial Model を押して基準点の修正を行います。修正されたら、Doneを押して細かい整列とトモグラムの計算過程に進みます。

軸 Aセットについて上記で説明したことに従って、同じ手順を進めます。

簡単に: Fine Alignmentボックス中Global variable のCompute Alignmentボタンを押します。

この時点で、大きな差をがある基準点を編集し、モデルを保存し、アライメントを計算することによって、 Aセットのように反復アラインメントを開始します。 アラインメントが完了したら、Doneを押して、スライス像の生成ステップに進みます。


トモグラフィーの自動位置決め

自動位置決めを使用するには、Find boundary model automatically(境界モデルを自動的に検索)にチェックを入れ、Positioning tomogram thicknessを再度200に設定します。


Create Samples & Boundary Model(サンプルと境界モデルの作成)とView Boundary Model(境界モデルの表示)ボタンが再ラベルされていることに注目してください。 自動断層撮影の位置決めは、標本または断層像全体のいずれかで行うことができます。そして、断層像全体は標準試料位置に十分な材料がない場合に、より精度が上がります。 ここではサンプルを使用しますが、断層像全体から境界モデルを調べるには多少異なる方法が必要です(詳細については、断層撮影ガイド全体の自動位置決めに関するセクションを参照してください)。

Create Samples&Boundary Modelを押します。 終了したら、View Boundary Modelを押して、描いた輪郭を調べます。

上記のA軸について概説した「最終整列スタック」の手順に進みます。

上記のA軸について概説したように、「断層像生成」ステップを続行します。






2つの軸を結合する

Axis Aボタンを押してA Axisに戻ります。 2つの断層像を結合するには、断層像の組み合わせプロセスボタンを押します。


断層撮影組み合わせパネル 断層像コンビネーションパネルは:3つのタブに整理され、セットアップ、 初期マッチ、そして決勝マッチ。 セットアップ情報は、特定のデータセットについて与えられるウィンドウがあります。最初のセクションでは、Tomogram Matching Relationshipについて説明します。B断層像をAに一致させることが最も一般的です。 Solvematch Parametersボックスに基準マーカの分布に関する情報が表示されます。この例では、基準点は両側にあります。このデータセットの場合、プログラムは一度にすべてのポイントに適合する問題がないため、Aから使用する開始ポイントを記入する必要はありません。 次のセクションでは、ローカル3D相互相関を使用して配置を精緻化するためのパッチパラメータの情報を示します。小さなパッチを選択します。どちらの中のパッチや大型パッチはほとんどのデータ・セットのために必要とされるが、このデータセットは、そのサイズを小さくするためにビニングされていますので、小さなパッチは、それらの情報をたくさん持っています。自動パッチフィッティングを使用するチェックボックスがオンになっていることに注意してください。十分な情報が見つからない場合、IMOD 4.9のこの新しい機能は自動的にパッチのサイズを増やします。パッチサイズは不必要に増加しません。 自動パッチフィッティングが選択されている場合、プログラムはボリュームに存在する情報の量も分析し、十分な情報がないパッチを除外しようとします。この手順で十分に機能しない場合は、パッチを抽出する領域を示す古い方法に戻ってください。これらの方法でいくつかの経験をするために、ボリュームの座標制限を設定する手順を説明します。 パッチが抽出されるボリュームの限界を指定する必要がある場合、一致する断層像を見ることが重要です。Z軸の範囲全体を使用することはほとんどできません。また、X軸とY軸の場合でも、デフォルトを使うのは良いことではありません。制限を見つけるには、パネルの下部にある3dmod Volume Aボタンを押します。これは3dmodでBBa.recを開きます。画像を一歩一歩見て、X軸、Y軸、Z軸のどの範囲にボリュームのマッチングに役立つ情報が含まれているかを決定します。この例では、X軸とY軸のデフォルトが維持されています。 この例ではZ軸分とZ軸の最大スライス内の約半分の材料(23および74)ぼやけない最初と最後のスライスに設定しました。




場合によっては、座標の制限値を設定しても、2つの軸が結合できるように十分に空の領域が削除されるわけではありません。その場合は、パッチ領域モデルを作成する必要があります。パッチ領域モデルを作成するには、パッチ領域モデルを使用するチェックボックスをオンにし、[パッチ領域モデル の作成/編集 ]ボタンを押して、一致する軸を開きます。モデルモードでは、生物学的材料を含む領域の周りを閉じた輪郭をトレースします。断層像で10スライスごとにこれを行います。モデルを保存します。名前はpatch_region.modです。パッチ領域モデルを作成することは、画像内に多量の樹脂または空き領域を有するデータセットを再構築する場合に特に有用である。このサンプルデータセットは、パッチ領域モデルを必要としません。 セットアップパネルの パラメータを入力したら、Create Combine Scriptsを押して、結合手順でさまざまなプログラムを実行する一連のコマンドファイルを作成します。ポップアップする警告メッセージは無視してください。Start Combineを押すと、2軸断層像の組み合わせが開始されます。Etomoは、様々なプログラムが実行されている間、自動的にInitial Matchに進み、最後にFinal Matchタブに進みます。 断層像の合成が完了したら、Open Combined Volumeを押して、最終断層像を表示します。最後のステップに進むには完了を押します。


中間ファイルの後処理およびクリーンアップ

後処理には、ボリュームトリミングとバイトスケーリングのステップと、それに続く中間ファイルの削除が含まれます。また、ボリュームを平坦化し、縮小したボリュームを作成するオプションもあります。非常に大きなデータセットで作業する場合はこれらの両方が便利であり、フラット化はシリアルセクションを再構築するときに特に役立ちます。使用方法の説明は、「トモグラフィガイド」の「POST-PROCESSING」セクションにあります。


2つの軸の1つに結合された最終的な再構成は、常にsum.recと呼ばれます。(単一の軸データセットがある場合、この時点での再構成ファイルの名前は、データセット名とそれに続く_full.recです。)3dmod Full Volumeを押してsum.rec再構築を開きます。再構成をステップ実行して、最終ボリュームのX、Y、Z範囲を決定します。XとYの範囲を設定する便利な方法は、Zapウィンドウのツールバーのラッシュバンドを破線の四角形でオンにし、マウスの左ボタンを押して目的の領域の左上隅を押し、マウスを下にドラッグします右隅。必要に応じてZを設定することもできます。Loを押して最小ZとHiを設定します最大Zを設定します。3dmodからGet XYZ Volume Rangeを押すと、3dmodからゴムバンド(Xバンドが設定されている場合はZ値)のX値とY値が取得されます。この例では、XとYのデフォルト範囲が使用されています。非細胞性物質を排除するために、Z軸(フリップトモグラム内)の範囲は、Z minが19であり、Z maxが67であるように設定されている。最後に、スケーリング範囲を設定して、金ビーズを除外するスライスの範囲を見つけます。この例では、スケーリングはセクションに基づいており、スライス24と70の間の範囲を持っています(3dmodを使用してこれらの数値を入力する場合は以下を参照)。 ゴールドを含まないスライスの範囲を見つけることができないことがあります。例えば、ここで使用されているサンプルには、セルの外側のプラスチック樹脂上に、スケーリングに使用する同じスライスに現れる金粒子が含まれています。このような金粒子を排除するためのXおよびYスケール範囲を制限することにより、最終的な断層像のコントラストが改善される。3dmod Full Volumeボタンを押しZAPウィンドウを立ち上げます。金粒子を示すスライスに移動し、それらを除く領域の周りにラバーバンドを置きます。これを行うには、Zスライダーの左のラバーバンドトグルを押します。


目的の領域の左上隅にマウスの左ボタンを押し、マウスを右下隅にドラッグします。次に、Zスライダをスケーリング範囲の下側に移動して(24)、Loを押します。Zスライダーをスケーリング範囲(70)の上部に移動しHiを押します。










EtomoのScalingボックスに移動し、Get XYZ Sub-Area From 3dmodボタンを押します。これにより、Etomoは選択したX、Y、Zの値を取得します。デフォルトの方向変更オプションは、特別なオプションなしで3dmodや他のプログラムで簡単に読み込めるように、最終的なボリュームをX軸回りに回転させます。Trimvolを実行するにはTrim Volumeボタンを押します。Trimvolは、ボリュームをトリミングしてバイトに変換するための単一のツールです。最後に、3dmod Trimmed Volumeを押して、トリムされた最後のボリューム(BB.recという名前)を表示します。Doneを押してファイルのクリーンアップに進みます。 中間ファイルのクリーンアップ:


ファイルのクリーンアップは非常に重要です。断層像生成プロセスは、多くの大きな中間ファイルを生成する。Intermediate file cleanupボックスは、我々は削除することができ、中間、非必須ファイル考えるもの示しています。最終的な断層像が本当に最終的なものであることを確認したら、中間ファイルを強調表示し、Delete Selectedボタンを押して選択することができます。すべてのファイルをハイライト表示するには、1つのファイルをクリックして、CtrlキーとAキーを同時に押します (OSXのコマンドとA)。 最終的な二重軸断層像はBB.recと名付けられ、3dmod BB.recコマンドを使用してEtomoの外で見ることができます。 トモグラムの多くの細胞機能のモデリングについては、3dmodの紹介を参照してください。これは簡単なデータセットであり、自分自身のデータでさらに問題が発生する可能性が高いため、実際のデータセットの作業を開始するときは、「 トモグラフィガイド」を読んでください。また、Etomoの使用法を読むと、Etomoをより効果的に使用することができます ヘルプへのアクセスや並列処理の設定などの機能について説明しています。最後に、バッチ再構成チュートリアルの指示に従ってこのデータセットを処理すると、再構成を高速化するためのバッチ処理の可能性を確認できます。