Electron Tomography

電子線トモグラフィー is,電子顕微鏡を用いた３次元再構成法の一つで,the same photo fieldを様々な方向からのProjectionされた電子顕微Mirror Imageをコンピュータの中で三次元像に再構成し,コンピュータを使って断層像(トモグラム)をCreateする手法です.

　下記にその手順を順に述べていきます.

take tilt-series images

　この手法で撮影すると試料を特定の軸に対して一定間隔で傾斜した画像になります.また,傾斜角度が大きくなるにつれて視野は広くなるので,映っている物体は傾斜軸の中心に集まってきます.

１軸傾斜 (中央が0°'s image)

２軸傾斜's imageを得るときはときは試料を90°回転させて,1軸傾斜と同様の方法で撮影します.

２軸傾斜(中央が0°'s image)(上's imageより90°回転した向きになっている)

画像の補正

　傾斜画像では,視野全体がアンダーフォーカスとなるように,通常の電子顕微鏡撮影よりも大きなデフォカース値をとる場合が多いです.その場合,LaB6などの電子銃では第一トーンリングより外側のInformationがほとんど無いために, CTF Correction等は必要ありませんが,電界放出銃を利用した場合には,場合によっては間違ったInformationを与える場合があるので注意が必要です.

Rough Alignment

　傾斜画像の中心付近's imageの相関から,それぞれの傾斜画像の大まかな位置を合わせます.

Input file(Y-axis周りに±60°の範囲で2°刻みで回転)

10°刻みで表示

前処理(窓関数)

　窓関数を掛けて画像端のNoiseを除去します.

今回は横80%,縦90%の窓関数を掛けます.

コマンド(1枚目の場合): mrcImageWindowing -i Set1000.roi -o Set1000.mask -W 0.2 0.2 0.1 0.1

こちらのMakefileを使用すると全てのroifileについて処理を行います.

Setting内容

# For Windowing
WIN_X=0.2
WIN_X_MAX=0.2
WIN_Y=0.1
WIN_Y_MAX=0.1
WIN_MODE=18

コマンド

make Windowing

Output file(.mask)

10°刻みで表示

位置合わせ

　傾斜角度に応じて対象がparallel transformしているので,位置を合わせます.このとき傾斜による影響を受けにくくするために隣同士の角度で位置合わせを行います.

例. 2°刻みで撮影した画像の場合
　2°画像の位置を0°画像の位置に合わせる
　4°画像の位置を位置補正後の2°画像の位置に合わせる
　6°画像の位置を位置補正後の4°画像の位置に合わせる
　.
　.

　(+が終わったら-についても同様に位置を合わせる)

mrcImageCorrelationを使用した場合

　こちらのMakefileを使用して位置合わせを実行します.Makefileを使用せずにコマンドを逐次Inputしても位置合わせは可能ですが,mrc2Dto3D用のInput fileリストをCreateする必要があります.

実行例1

Input file

10°刻みで表示

コマンド

make CorFit1

Output file(.fit)

10°刻みで表示

Fine Alignment

　傾斜画像の軸の位置,角度を出来る限り一致させます.

実行例1(傾斜軸の調整)

　軸の傾きはmrcImageTiltAxisSearchで算出することができます.

Input file(傾斜軸を10°傾けた１軸傾斜のdata)

10°刻みで表示

使用MakefileのSetting

# RotMode
ROTMODE=ZOYS
# Rot1
ROT1MIN=10
ROT1MAX=10
ROT1D=10
# Rot2
ROT2MIN=-60
ROT2MAX=60
ROT2D=2
# Rot3
ROT3MIN=0
ROT3MAX=0
ROT3D=30
### For mrcImageMove
SHIFT2MAX=10
SHIFT3MAX=0
### For mrcImageTiltAxisSearch
TILTMIN=0
TILTMAX=20
TILTN=10
TILTITER=1
TILTSCALE=5

コマンド

make TiltFit

Outputした軸の傾き(.tiltinfofileに格納される)

9.895

３次元再構成したときの違い

補正前
補正後
xy-plane	yz-plane	zx-plane

実行例2(傾斜軸の繰り返し調整)

Outputされた軸の傾きを中心として,繰り返しmrcImageTiltAxisSearch.

Input file(傾斜軸を1°傾けた１軸傾斜のdata)

10°刻みで表示

使用MakefileのSetting

# For mrcImageTiltAxisSearch
IN_TILT_EXT=roi
# RotMode
ROTMODE=ZEYR
# Rot1
ROT1MIN=1
ROT1MAX=1
ROT1D=1
# Rot2
ROT2MIN=-60
ROT2MAX=60
ROT2D=10
# Rot3
ROT3MIN=0
ROT3MAX=0
ROT3D=10
### For mrcImageTiltAxisSearch
TILTMIN=-10
TILTMAX=10
TILTN=10
TILTITER=100
TILTSCALE=5

コマンド

make TiltFit

軸の傾きの遷移

0.084
0.161
0.230
0.294
0.345

...

0.701
0.700
0.685
0.706
0.701

傾斜軸の傾きが1付近に近づきます.

3D Reconstruction

　２次元画像のセットから３次元画像を再構成します.

元の3Ddata's image

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

0 (0, 0, 0) 4 (31, 26, 26) 0.0116844 0.147033 0.000287174

mrc2Dto3D

実行例1(1軸傾斜での再構成)

　連続傾斜像の撮影で軸にズレがない場合は角度刻みをそのままInput fileリストにSettingします.

Input file

10°刻みで表示

コマンド: mrc2Dto3D -i Input.3dlst -o Input.3d -m 1

こちらのMakefileを使用すれば,以下のコマンドでも実行できます.

Setting内容

# For Reconstruction
IN_3D_EXT=fit
# RotMode
ROTMODE=YOYS
# Rot1
ROT1MIN=-60
ROT1MAX=60
ROT1D=2
# Rot2
ROT2MIN=0
ROT2MAX=0
# Rot3
ROT3MIN=0
ROT3MAX=0

コマンド

make 3DList
make Input.3d

Output file(Input.3d)

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00437076 (39, 34, 36) 0.00799233 (37, 34, 36) 3.45089e-06 0.000342836 6.69601e-07

実行例2(2軸傾斜での再構成)

２軸で傾斜した画像にて３次元再構成を行います.

Input file(X, Y-axis周りに±60°の範囲でそれぞれ10°刻みで傾斜)

1行目がX-axis傾斜,２行目がY-axis傾斜

こちらのMakefileを使って３次元再構成を行います.

コマンド

make all

途中で使用する範囲を決めるためにDisplay2が起動しますが,今回は全ての範囲を選択してROIInformationを保存します.
今回OutputしたInformationfile

DataA_006.mrcsmth-0000.roi Rect        0.000000       0.000000       63.000000       0.000000       63.000000       63.000000        0.000000       63.000000

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-9.32199 (29, 37, 34) 21.995 (40, 35, 32) 0.0280746 1.38771 0.00271036

実行例3(Doubleを使用した2軸傾斜での再構成)

mrc2Dto3DのOption -Doubleを使用して３次元再構成を行います.

変更箇所

.roilst.mrc3d:
#	mrc2Dto3D -I $*.roilst -o $*.mrc3d -single 0 -InterpolationMode 2 -m 1 
	mrc2Dto3D -I $*.roilst -o $*.mrc3d -Double -InterpolationMode 2 -m 1 

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-10360.9 (41, 24, 0) 8132.05 (40, 35, 31) 86.0574 673.594 1.31561

ラドン変換を使った３次元再構成

　mrc2Dto3Dを使用するほかにラドン変換から３次元像を作る方法があります.ラドン変換は以下の流れで行います.

位置合わせ済みの2Dリスト
↓mrcImageSinogramCreate
Sinogramリスト
↓mrcRadon2Dto3D
3Dラドンfile
↓mrcImageInverseRadonTransform

3Dfile(完了)

実行例1

こちらのMakefileを使い,実行例2でCreateされた .roilstfileについて実行します.

コマンド

make Radon3D

Output file

xy-plane	yz-plane	zx-plane

Min Max Mean SD SE

1.84923e+06 (0, 59, 28) 1.17991e+07 (34, 31, 30) 3.63631e+06 1.64358e+06 3536.42

実行例2

　こちらのMakefileから逆ラドン変換のOptionを変更して実行します.

変更内容

### RadonTransform
RBP_MODE=4
RBP_OPTION=-Rmin 0.05 -Rmax 0.1

コマンド

make Radon3D

Output file

xy-plane	yz-plane	zx-plane

Min Max Mean SD SE

-344789 (25, 25, 0) 631546 (37, 34, 28) 4381.1 76358.4 164.297

Problems of 3D Reconstruction

ミッシングエリア

　全方位からのProjection像を得られないために,ミッシングエリア(１軸の場合はウェッジ,２軸の場合はピラミッド)とよばれるInformationがない領域があります.そのため,方向依存でのボケを生じます.

使用MakeFile.

元の３次元像(Target.ini3dにリネーム)

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

0 (0, 0, 0) 2 (29, 29, 14) 0.108302 0.364429 0.000711774

１軸回転でProjectionして３次元再構成した場合(Y-axis: -60° ~ 60°: 10°刻み)

変更箇所

TILTAXISNUMBER=1	# Single: 1 Double: 2 

コマンド

make Target.ini2d
make TestData2DSet
make all

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00330818 (52, 36, 32) 0.00425516 (13, 37, 32) 2.08481e-05 0.000467848 9.13766e-07

２軸回転でProjectionして３次元再構成した場合(X, Y-axis: 各-60° ~ 60°: 10°刻み)

変更箇所

TILTAXISNUMBER=2	# Single: 1 Double: 2 

コマンド

make Target.ini2d1
make TestData2DSetDouble
make all

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00248567 (12, 38, 32) 0.00344027 (13, 37, 32) 2.07529e-05 0.000401237 7.83666e-07

画像の位置,フォーカスの問題

　試料を傾けながら撮影するため回転軸からの距離に応じてレンズとの距離が変化していきます.これによって生じる問題をいかに補正するかも一つのポイントとなります.

parallel transformの補正

　傾斜する角度が大きくなるほど,視野が広くなるため試料は傾斜軸の方へ近づいていきます.これを補正するためにmrcImageCorrelationなどを使ってどれだけparallel transformが必要かを計算します.また,試料を傾斜する毎に形も変わっていきますので比較はできるだけ近い画像同士で行います.

軸の決定

　撮影した画像は必ずしもSettingした軸を中心に傾斜しているとは限りません.これは電子顕微鏡自体の性能や試料の設置方法などによって多少のズレが生じてしまうからです.傾斜軸のズレはmrcImageTiltAxisSearchなどを使って計算します.

トモグラフに使われる画像処理

　再構成した３次元画像のAnalysisを行う前処理として以下のような処理を施します.

Smoothing

　再構成した３次元像のNoiseを除去するためSmoothingを行います.

実行例1

Input file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00268221 (76, 92, 66) 0.00642324 (89, 42, 71) 2.0386e-06 0.000254286 1.63933e-07

コマンド: mrcImageSmoothing -i Input-Tomogram3D.mrc -o Input-TomogramSmth.mrc -m 1

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00136636 (75, 42, 133) 0.00292404 (94, 65, 68) -9.48921e-07 0.00013513 8.71152e-08

セグメンテーション

　２次元画像や３次元画像を必要な部分ごとに切り出します.

３次元画像の切り出し

　再構成された３次元画像から粒子と考えられる部分などを切り出します.切り出したdataは３次元画像のAnalysisや平均化するときに使用することができます.

実行例1

切り出したい部分のcoordinates,Widthが分かっている場合はmrcImageCenterGetを使います.

Input file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.00136636 (75, 42, 133) 0.00292404 (94, 65, 68) -9.48921e-07 0.00013513 8.71152e-08

コマンド: mrcImageCenterGet -i Input-TomogramSmth.mrc -o Input-TomogramSub.mrc -Cx 67 -Cy 67 -Cz 67 -Nx 27 -Ny 27 -Nz 27

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.0012017 (5, 9, 13) 0.00263957 (13, 6, 15) 2.22923e-05 0.000388094 2.76625e-06

２次元画像の切り出し

　視野全体ではなく,一部だけ再構成するために傾斜画像から部分的に２次元画像を切り出す場合もあります.視野全体の再構成よりもコストが削減されるので,部分的なdataだけあれば十分な場合はこの手法を用います.試料を傾けながら撮影しているので,画像から切り出す位置や角度を画像によって変える必要があります.切り出すときにはmrcImageCenterGetやmrcImageROI,mrcImageROIsなどを使用します.切り出し範囲を全て手動で決めるのはかなりの時間を要しますので,基準(0°)'s imageでの切り出し範囲を手動で決めると残りの切り出し位置を傾斜角度に応じて自動で計算して切り出しを行う方法をとります.

操作動画: (.mov) (.mp4)

以下の流れで３次元再構成まで行います.

傾斜画像(2D画像複数)(前処理済)

↓	切り出し範囲のSetting(Display2: 0°'s imageのみ)

0°の切り出しInformationfile(ROIInformation)

↓	各傾斜画像の切り出し範囲を計算する(現在はMakefile内で処理)

各傾斜画像の切り出しInformation

↓	画像の切り出し(mrcImageROIs)

切り出された複数's imagefile(切り出し数 × 傾斜数分)

↓	位置合わせ(mrcImageCorrelarion + Makefileの処理)

位置合わせ済みの切り出しInformation(傾斜数分)

↓	再度画像の切り出し(mrcImageROIs) (※ 切り出し画像をシフトするのではなく,切り出し位置を再Settingして切り出します)

位置合わせ済み's image(ROI)file(切り出し数 × 傾斜数分)

↓	角度InformationfileのCreate(Makefile内の処理)

角度Informationfile(切り出し数分)

↓	３次元再構成(mrc2Dto3D)

3次元画像(切り出し数分)

実行例1(1軸傾斜のサブトモグラム)

Input file's image(一部)(y-axis回転: -60° ~ 60°: 2°刻み)

-60°(p1_001.mrc)

0°(p1_031.mrc)

60°(p1_061.mrc)

こちらのMakefile.

コマンド

make all

コマンドをInput後にDisplay2(2Dビューワー)が開きますので,切り出したい部分(複数可)を選択しInformationfile(.roiinfo)をCreateします.

切り出し部分決めてEdit->OKで決定します.	複数切り出したいときはROI->MultiROIを選択します.

今回はInformationだけCreateすれば,切り出しは自動で行われます. ROI InformationウィンドウにてInfoFileName右側のsaveボタンを押すとfileがCreateされます. (またはExtractModeをInformationにしてExtractボタンを押します.)

今回OutputしたInformationfile

p1_031-0000.roi	Rect	20	30	60	30	60	70	20	70
p1_031-0001.roi	Rect	15	75	55	75	55	115	15	115
p1_031-0002.roi	Rect	25	110	65	110	65	150	25	150
p1_031-0003.roi	Rect	45	0	85	0	85	40	45	40
p1_031-0004.roi	Rect	60	50	100	50	100	90	60	90
p1_031-0005.roi	Rect	55	80	95	80	95	120	55	120
p1_031-0006.roi	Rect	55	120	95	120	95	160	55	160
p1_031-0007.roi	Rect	85	15	125	15	125	55	85	55
p1_031-0008.roi	Rect	85	51	125	51	125	91	85	91
p1_031-0009.roi	Rect	85	91	125	91	125	131	85	131
p1_031-0010.roi	Rect	93	130	133	130	133	170	93	170
p1_031-0011.roi	Rect	115	25	155	25	155	65	115	65
p1_031-0012.roi	Rect	120	60	160	60	160	100	120	100
p1_031-0013.roi	Rect	123	100	163	100	163	140	123	140
p1_031-0014.roi	Rect	115	140	155	140	155	180	115	180
p1_031-0015.roi	Rect	152	152	192	152	192	192	152	192

1枚's imageについてDisplay2からInformationfile(.roiinfo)をCreateすると,残り's imageについては傾きから切り出す範囲を計算し,自動で切り出しが行われます.

自動で切り出された画像(縦: 選択範囲毎, 横: file(角度)毎)(.pad)

-60°	0°	60°

切り出し処理を終えた後はそれぞれ's imageに対して３次元再構成が行われます.

再構成されたそれぞれの３次元画像(.mrc3d)

xy-plane
yz-plane
zx-plane

実行例2(2軸傾斜のサブトモグラム)

　２軸で傾斜した画像から切り出し及び再構成を行ってみます.

Input file's image(一部)(x-axis, y-axis回転: -60° ~ 60°: 10°刻み)

x-axis回転	-60°	0°	60°
y-axis回転	-60°	0°	60°

こちらのMakefile.

コマンド

make all

今回はこの領域でROIfileの切り出しを行います.

今回OutputしたInformationfile

DataA_006-0000.roi Rect        0.722314      137.147614       33.000000      106.000000       49.053597      122.636041       16.775911      153.783654
DataA_006-0001.roi Rect       15.000000       79.000000       42.000000       79.000000       42.000000      107.000000       15.000000      107.000000
DataA_006-0002.roi Rect       13.000000       39.000000       58.000000       39.000000       58.000000       64.000000       13.000000       64.000000
DataA_006-0003.roi Rect       41.000000      129.000000       84.000000      129.000000       84.000000      154.000000       41.000000      154.000000
DataA_006-0004.roi Rect       51.000000       85.000000       82.000000       85.000000       82.000000      119.000000       51.000000      119.000000
DataA_006-0005.roi Rect       47.269722       69.494676       78.455043       40.316766       95.000000       58.000000       63.814679       87.177909
DataA_006-0006.roi Rect       66.000000        4.000000       92.000000        4.000000       92.000000       44.000000       66.000000       44.000000
DataA_006-0007.roi Rect       77.597890      150.922358       95.484138      132.052220      120.886248      156.129861      103.000000      175.000000
DataA_006-0008.roi Rect       93.000000       92.000000      115.000000       92.000000      115.000000      132.000000       93.000000      132.000000
DataA_006-0009.roi Rect      100.000000       51.000000      121.000000       51.000000      121.000000       93.000000      100.000000       93.000000
DataA_006-0010.roi Rect       98.589377       19.087800      119.760822       10.100593      135.000000       46.000000      113.828555       54.987208
DataA_006-0011.roi Rect      122.000000      141.000000      146.000000      141.000000      146.000000      184.000000      122.000000      184.000000
DataA_006-0012.roi Rect      136.883039       95.213292      160.000000      104.000000      144.116961      145.786708      121.000000      137.000000
DataA_006-0013.roi Rect      127.000000       73.000000      146.061183       60.635990      169.000000       96.000000      149.938817      108.364010
DataA_006-0014.roi Rect      140.000000       22.000000      177.361289       43.286947      166.470292       62.402025      129.109004       41.115078
DataA_006-0015.roi Rect      163.000000      152.000000      183.000000      152.000000      183.000000      190.000000      163.000000      190.000000

自動で切り出された画像(縦: 選択範囲毎, 横: file(角度)毎)(.pad)

DataA(x-axis回転)

DataB(y-axis回転)

切り出しサイズがバラバラで分かりにくくなっていますが,いずれの傾斜軸でもROIfileが自動で切り出されています.

再構成されたそれぞれの３次元画像(.mrc3d)

xy-plane
yz-plane
zx-plane

トモグラム画像の解釈

　また,多様な構造を含むため,３次元画像から興味あるセグメントを切り出すなどの作業が必要です.そのための支援ソフトウェアが必要です.

Averaging of Subtomograms

　セグメンテーションによって分割された３次元data同士が別方向を向いている同じ粒子であるとき,それを平均化することでミッシングエリアを補間し,より精密な３次元像にすることができます.

分割したdata1

分割したdata2(90°向きが違う)

平均したdata

xy-plane	yz-plane	zx-plane

実行例1

Input file

xy-plane
yz-plane
zx-plane

３次元像を平均化する前にmrcImageAutoRotationCorrelation3Dを使って,向きを合わせます.

Reference file(Input fileの真ん中のdataを使用)

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.0012017 (5, 9, 13) 0.00263957 (13, 6, 15) 2.22923e-05 0.000388094 2.76625e-06

コマンド: mrcImageAutoRotationCorrelation3D -i c1-1.mrc -r c2-2.mrc -fit f1-1.mrc -EA YOYS -Rot1 0 0 30 -Rot2 0 330 30 -Rot3 0 330 30 -Xrange 0 0 -Yrange 0 0 -Zrange 0 0

補正後のdata(-fitのOutput file)

xy-plane
yz-plane
zx-plane

補正fileに対し,mrcImageAverageにて平均化を行います.

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-0.000536652 (6, 13, 12) 0.00177258 (13, 17, 13) 3.22171e-05 0.000228739 1.6304e-06

平均化することにより３次元像の質(特にyz-plane)が良くなりました.

実行例2

Input file

xy-plane
yz-plane
zx-plane

Reference file(Input fileの先頭のdataを使用)

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-5.47817 (34, 19, 20) 16.0715 (31, 22, 19) 0.142234 1.22547 0.0048441

同様にまず向きを合わせます.

コマンド: mrcImageAutoRotationCorrelation3D -i p1-0001.mrc3d -r Target.mrc3dref -fit p1-0001.3dfit -EA XEYR -Rot1 0 355 5 -Rot2 0 355 5 -Rot3 0 0 30 -M 18

補正後のdata(-fitのOutput file)

xy-plane
yz-plane
zx-plane

Reference fileに向きを合っているものと合っていないものがあります.
これはそれぞれのサブトモグラムの３次元像にてミッシングエリアが異なるので,どちらかにdataがない角度では相関値が大Widthに下がってしまうためです.

補正fileに対し,mrcImageAverageにて平均化を行います.

Output file

xy-plane

yz-plane

zx-plane

Min Max Mean SD SE

-2.32263 (22, 29, 20) 5.20816 (19, 24, 22) 0.0844992 0.49404 0.00195286